بررسی جامع اگزوزوم‌ها: از بیولوژی پایه تا پتانسیل‌های بالینی

I. مقدمه‌ای بر اگزوزوم‌ها

• A. تعریف و اهمیت پایه

اگزوزوم‌ها به عنوان دسته‌ای متمایز از وزیکول‌های خارج سلولی (Extracellular Vesicles – EVs) شناخته می‌شوند که منشأ آن‌ها سیستم اندوزومی سلول است. این نانووزیکول‌ها توسط تقریباً تمام انواع سلول‌های یوکاریوتی، از سلول‌های ایمنی و بنیادی گرفته تا سلول‌های سرطانی و عصبی، به محیط خارج سلولی آزاد می‌شوند.¹

اهمیت بنیادین اگزوزوم‌ها در نقش آن‌ها به عنوان واسطه‌های کلیدی در ارتباطات بین سلولی نهفته است. آن‌ها بسته‌هایی حاوی مولکول‌های زیست‌فعال متنوعی از جمله پروتئین‌ها، لیپیدها و انواع مختلف اسیدهای نوکلئیک (مانند RNA و DNA) هستند که می‌توانند این محموله را به سلول‌های گیرنده، چه در مجاورت و چه در فواصل دور، منتقل کنند.¹ این انتقال اطلاعات مولکولی می‌تواند به طور قابل توجهی بر فرآیندهای فیزیولوژیکی طبیعی مانند پاسخ ایمنی، ترمیم بافت و هموستاز و همچنین در پاتوژنز بیماری‌های مختلف از جمله سرطان، بیماری‌های نورودژنراتیو و قلبی-عروقی تأثیر بگذارد.³ توانایی اگزوزوم‌ها در تعدیل عملکرد سلول‌های گیرنده، همراه با حضورشان در مایعات بدن و پایداری نسبی محموله‌شان، آن‌ها را به اهداف جذابی برای تحقیقات در زمینه نشانگرهای زیستی (بیومارکرها) برای تشخیص و پیش‌آگهی بیماری‌ها و همچنین به عنوان عوامل درمانی بالقوه یا سیستم‌های نوین تحویل دارو تبدیل کرده است.¹

• B. زمینه تاریخی

کشف اگزوزوم‌ها به اوایل دهه 1980 بازمی‌گردد، زمانی که محققان در حال مطالعه فرآیند بلوغ رتیکولوسیت‌ها به گلبول‌های قرمز بودند. در این مطالعات مشاهده شد که وزیکول‌های کوچکی از سلول‌ها آزاد می‌شوند که حاوی گیرنده‌های ترانسفرین بودند که دیگر برای سلول بالغ مورد نیاز نبودند.³ در ابتدا، این وزیکول‌ها به عنوان مکانیسمی برای دفع مواد زائد یا مولکول‌های غیرضروری از سلول در نظر گرفته شدند و به نوعی “کیسه‌های زباله سلولی” تلقی می‌شدند.³ اصطلاح “اگزوزوم” توسط رز جانستون (Rose Johnstone) برای توصیف این وزیکول‌های آزاد شده در طی تمایز رتیکولوسیت‌ها ابداع شد.³

با گذشت زمان و پیشرفت تکنیک‌های تحقیقاتی، درک عملکرد اگزوزوم‌ها به طور چشمگیری تکامل یافت. مشخص شد که این وزیکول‌ها تنها حامل مواد زائد نیستند، بلکه نقش‌های پیچیده‌تری در ارتباطات بین سلولی ایفا می‌کنند.³ کشف اینکه اگزوزوم‌ها می‌توانند مولکول‌های عملکردی مانند پروتئین‌ها و RNA ها را به سلول‌های دیگر منتقل کنند و بر فنوتیپ و رفتار آن‌ها تأثیر بگذارند، نقطه عطفی در این زمینه بود. این یافته‌ها منجر به افزایش تصاعدی علاقه تحقیقاتی به اگزوزوم‌ها در دهه‌های اخیر شده است، زیرا نقش‌های حیاتی آن‌ها در تنظیم فرآیندهای فیزیولوژیکی طبیعی و دخالت آن‌ها در پاتوژنز بیماری‌های مختلف آشکارتر شد و پتانسیل عظیم آن‌ها برای کاربردهای بالینی در تشخیص و درمان مورد توجه قرار گرفت.¹

• C. تمایز از سایر وزیکول‌های خارج سلولی

اصطلاح وزیکول‌های خارج سلولی (EVs) به طیف وسیعی از وزیکول‌های غشادار اشاره دارد که توسط سلول‌ها به محیط خارج سلولی آزاد می‌شوند. اگزوزوم‌ها تنها یکی از انواع اصلی EV ها هستند و تمایز آن‌ها از سایر انواع، عمدتاً بر اساس مسیر بیوژنز (نحوه تولید) و اندازه آن‌ها صورت می‌گیرد.

دو دسته اصلی دیگر از EV ها عبارتند از:

1. میکرووزیکول‌ها (Microvesicles – MVs): که گاهی اوقات اکتوزوم (Ectosomes) یا میکروپارتیکل (Microparticles) نیز نامیده می‌شوند، مستقیماً از طریق جوانه زدن به سمت بیرون غشای پلاسمایی سلول تشکیل می‌شوند. اندازه آن‌ها معمولاً بزرگتر از اگزوزوم‌ها است و در محدوده 50 نانومتر تا 1 میکرومتر (1000 نانومتر) یا به طور رایج‌تر 100 تا 1000 نانومتر گزارش می‌شود.⁶
2. اجسام آپوپتوتیک (Apoptotic Bodies – APOs): این وزیکول‌ها بزرگترین نوع EV ها هستند (معمولاً 50 تا 5000 نانومتر) و در طی فرآیند مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی (آپوپتوز) از سلول‌های در حال مرگ آزاد می‌شوند و ممکن است حاوی قطعات هسته یا سایر اندامک‌ها باشند.⁹

ویژگی کلیدی که اگزوزوم‌ها را از میکرووزیکول‌ها و اجسام آپوپتوتیک متمایز می‌کند، منشأ اندوزومی آن‌هاست. اگزوزوم‌ها در داخل ساختارهایی به نام اجسام چند وزیکولی (Multivesicular Bodies – MVBs) در مسیر اندوسیتوزی تشکیل می‌شوند و سپس با همجوشی MVB با غشای پلاسمایی به خارج از سلول آزاد می‌گردند.¹

با این حال، طبقه‌بندی EV ها بر اساس اندازه و بیوژنز همیشه واضح و قطعی نیست. همپوشانی قابل توجهی در محدوده اندازه بین انواع مختلف EV ها، به ویژه بین اگزوزوم‌های بزرگ و میکرووزیکول‌های کوچک، وجود دارد.¹⁰ علاوه بر این، روش‌های جداسازی رایج، مانند اولتراسانتریفیوژ، اغلب قادر به جداسازی کامل این جمعیت‌ها از یکدیگر نیستند و منجر به آماده‌سازی‌هایی می‌شوند که ممکن است حاوی ترکیبی از انواع مختلف EV باشند.⁸⁴ این ناخالصی‌ها می‌توانند تفسیر نتایج مطالعات عملکردی یا درمانی را پیچیده کنند. به همین دلیل، دستورالعمل‌های بین‌المللی مانند MISEV 2018 (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles) بر اهمیت استفاده از ترکیبی از روش‌ها برای جداسازی و خصوصیات دقیق EV ها، شامل ارزیابی اندازه، مورفولوژی، نشانگرهای پروتئینی (هم مثبت و هم منفی) و در صورت امکان، مسیر بیوژنز تأکید می‌کنند تا تعریف دقیق‌تری از جمعیت وزیکولی مورد مطالعه ارائه شود.¹⁰ این چالش‌ها نشان می‌دهند که درک ما از بیولوژی EV ها همچنان در حال تکامل است و نیاز به توسعه روش‌های دقیق‌تر برای جداسازی و شناسایی زیرجمعیت‌های خاص EV وجود دارد.

II. بیوژنز و منشأ سلولی اگزوزوم‌ها

فرآیند تولید و آزادسازی اگزوزوم‌ها، که به عنوان بیوژنز اگزوزوم شناخته می‌شود، یک مسیر پیچیده و چند مرحله‌ای است که در سیستم اندوزومی سلول رخ می‌دهد.

• A. مسیر اندوزومی

بیوژنز اگزوزوم با فرآیند اندوسیتوز آغاز می‌شود، که طی آن بخشی از غشای پلاسمایی به داخل سلول فرورفته و وزیکول‌های اندوسیتوزی را تشکیل می‌دهد.⁷ مکانیسم‌های مختلفی می‌توانند در این مرحله نقش داشته باشند، از جمله اندوسیتوز وابسته به پروتئین کلاترین (Clathrin-mediated endocytosis)، اندوسیتوز وابسته به کاوئولین (Caveolin-dependent endocytosis) و مسیرهای مستقل از کلاترین و کاوئولین.²² این وزیکول‌های اولیه سپس با یکدیگر ترکیب شده و اندامک‌هایی به نام اندوزوم‌های اولیه (Early Endosomes) را ایجاد می‌کنند.

در مرحله بعد، اندوزوم‌های اولیه دچار بلوغ می‌شوند و به اندوزوم‌های تأخیری (Late Endosomes) یا اجسام چند وزیکولی (Multivesicular Bodies – MVBs) تبدیل می‌گردند.⁶ مشخصه اصلی MVB ها وجود وزیکول‌های کوچکتر در داخل لومن (فضای داخلی) آن‌هاست که به عنوان وزیکول‌های داخل لومنی (Intraluminal Vesicles – ILVs) شناخته می‌شوند.⁶ این ILV ها در نهایت پس از آزادسازی از سلول، اگزوزوم نامیده می‌شوند.

• B. مکانیسم‌های تشکیل ILV و مرتب‌سازی محموله

تشکیل ILV ها از طریق فرآیند جوانه زدن به سمت داخل غشای محدود کننده MVB صورت می‌گیرد. این فرآیند توسط مکانیسم‌های مولکولی مختلفی هدایت می‌شود که می‌توان آن‌ها را به دو دسته اصلی تقسیم کرد: مسیرهای وابسته به ESCRT و مسیرهای مستقل از ESCRT.

1. مسیر وابسته به ESCRT: ماشین مولکولی ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) نقش اصلی را در این مسیر ایفا می‌کند. این سیستم شامل چهار کمپلکس پروتئینی اصلی (ESCRT-0, -I, -II, -III) و پروتئین‌های کمکی مانند ATPase Vps4 است.⁷ کمپلکس‌های ESCRT به طور متوالی به غشای اندوزوم فراخوانده می‌شوند و در شناسایی و مرتب‌سازی پروتئین‌های غشایی (اغلب آن‌هایی که با یوبی‌کوئیتین نشانه‌گذاری شده‌اند) به داخل جوانه‌های در حال تشکیل ILV و همچنین در فرآیند نهایی جدا شدن وزیکول از غشاء نقش دارند.²⁰ به همین دلیل، پروتئین‌های مرتبط با ESCRT مانند Alix و TSG101 اغلب در اگزوزوم‌ها یافت می‌شوند و به عنوان نشانگرهای بیوژنز آن‌ها استفاده می‌گردند.⁷
2. مسیرهای مستقل از ESCRT: شواهد نشان می‌دهند که تشکیل ILV ها می‌تواند مستقل از ماشین ESCRT نیز رخ دهد. در این مسیرها، لیپیدها نقش کلیدی ایفا می‌کنند. به عنوان مثال، سرامید (Ceramide)، که توسط آنزیم اسفنگومیلیناز خنثی تولید می‌شود، می‌تواند باعث القای انحنای غشاء و جوانه زدن به داخل شود.⁷ همچنین، پروتئین‌های تتراسپانین (Tetraspanins) مانند CD9، CD63 و CD81 که در غشای اگزوزوم‌ها فراوان هستند، با سازماندهی میکرو دامنه‌های غشایی غنی از کلسترول و اسفنگولیپیدها (Tetraspanin-Enriched Microdomains – TEMs)، در مرتب‌سازی محموله و تشکیل ILV نقش دارند.⁷

فرآیند مرتب‌سازی محموله (Cargo sorting) به داخل ILV ها یک مرحله حیاتی است که ترکیب نهایی اگزوزوم را تعیین می‌کند. این فرآیند به نظر می‌رسد که تصادفی نبوده و به طور فعال تنظیم می‌شود، به طوری که مولکول‌های خاصی (پروتئین‌ها، انواع RNA، DNA و لیپیدها) به طور انتخابی در اگزوزوم‌ها غنی می‌شوند.³ ترکیب این محموله می‌تواند منعکس‌کننده نوع سلول والد، وضعیت فیزیولوژیکی یا پاتولوژیکی آن (مانند فعال‌سازی، استرس یا سرطانی شدن) و سیگنال‌های محیطی باشد.⁵

وجود مسیرهای بیوژنز متعدد (وابسته و مستقل از ESCRT) یکی از دلایل اصلی ناهمگونی (هتروژنیتی) مشاهده شده در جمعیت اگزوزوم‌ها، حتی آن‌هایی که از یک نوع سلول ترشح می‌شوند، است.⁷ مسیرهای مختلف ممکن است منجر به تولید اگزوزوم‌هایی با محموله مولکولی، ترکیب لیپیدی یا نشانگرهای سطحی متفاوت شوند که این امر به نوبه خود می‌تواند بر عملکرد بیولوژیکی و هدف‌گیری سلولی آن‌ها تأثیر بگذارد. درک اینکه کدام مسیرها در شرایط خاص فعال هستند، می‌تواند اهداف جدیدی را برای تعدیل تولید یا محتوای اگزوزوم‌ها برای مقاصد درمانی فراهم کند.

علاوه بر این، نقش لیپیدها، به ویژه کلسترول، در تعیین سرنوشت نهایی MVB ها قابل توجه است. مطالعات نشان داده‌اند که MVB هایی که غنی از کلسترول هستند، تمایل بیشتری به همجوشی با غشای پلاسما و آزادسازی اگزوزوم‌ها دارند، در حالی که MVB های با کلسترول کمتر ممکن است بیشتر به سمت تخریب لیزوزومی هدایت شوند.⁷ این یافته نشان می‌دهد که متابولیسم لیپیدی سلول می‌تواند مستقیماً بر میزان ترشح اگزوزوم تأثیر بگذارد. این ارتباط می‌تواند در بیماری‌های مرتبط با اختلالات متابولیسم لیپید مهم باشد و همچنین ممکن است راهی برای دستکاری دارویی آزادسازی اگزوزوم‌ها ارائه دهد.

• C. سرنوشت MVB و آزادسازی اگزوزوم

پس از تشکیل MVB ها و بارگیری ILV ها، این اندامک‌ها باید به سمت غشای پلاسمایی حرکت کنند تا محتویات خود را آزاد کنند. این انتقال درون سلولی به کمک اجزای اسکلت سلولی (مانند میکروتوبول‌ها و فیلامان‌های اکتین) و پروتئین‌های حرکتی صورت می‌گیرد.²⁰ پروتئین‌های خانواده Rab GTPase، که تنظیم‌کننده‌های کلیدی ترافیک وزیکولی هستند، نقش مهمی در هدایت MVB ها به مقصد صحیح ایفا می‌کنند.¹⁴

هنگامی که MVB به غشای پلاسمایی می‌رسد، فرآیند الحاق (Docking) و سپس همجوشی (Fusion) غشاء رخ می‌دهد. این همجوشی منجر به باز شدن MVB به فضای خارج سلولی و آزادسازی ILV های موجود در آن به عنوان اگزوزوم می‌شود.³ پروتئین‌های SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor) که در همجوشی غشاهای مختلف در سلول نقش دارند، در این مرحله نیز دخیل هستند.²³

البته، همه MVB ها به سمت ترشح اگزوزوم هدایت نمی‌شوند. یک سرنوشت جایگزین مهم برای MVB ها، همجوشی با لیزوزوم‌ها است که منجر به تخریب محتویات MVB (شامل ILV ها) می‌شود.⁷ همچنین، MVB ها می‌توانند با اتوفاگوزوم‌ها (وزیکول‌های دخیل در فرآیند اتوفاژی) همجوشی پیدا کرده و ساختارهایی به نام آمفیزوم (Amphisomes) را تشکیل دهند که این آمفیزوم‌ها نیز ممکن است با لیزوزوم‌ها برای تخریب یا با غشای پلاسما برای ترشح محتویاتشان همجوشی کنند.⁹ تعادل بین این مسیرها (ترشح در مقابل تخریب) احتمالاً تحت تنظیم دقیق سلولی قرار دارد و می‌تواند بر میزان و نوع اگزوزوم‌های آزاد شده تأثیر بگذارد.

• D. منابع سلولی متنوع

یکی از ویژگی‌های برجسته اگزوزوم‌ها این است که تقریباً توسط تمام انواع سلول‌های یوکاریوتی، چه در شرایط فیزیولوژیکی و چه پاتولوژیکی، تولید و ترشح می‌شوند.¹ این دامنه گسترده شامل موارد زیر است:

• سلول‌های ایمنی: لنفوسیت‌های T و B، سلول‌های کشنده طبیعی (NK)، سلول‌های دندریتیک (DCs)، ماکروفاژها، ماست سل‌ها.³
• سلول‌های بنیادی: سلول‌های بنیادی مزانشیمی (Mesenchymal Stem Cells – MSCs) از منابع مختلف (مغز استخوان، بافت چربی، بند ناف، پالپ دندان)، سلول‌های بنیادی عصبی (NSCs)، سلول‌های بنیادی پرتوان القایی (iPSCs).⁶
• سلول‌های سرطانی: انواع مختلف سلول‌های توموری.¹
• سلول‌های عصبی: نورون‌ها، سلول‌های گلیال (مانند سلول‌های شوان).²
• سایر انواع سلول: سلول‌های اپیتلیال، سلول‌های اندوتلیال، فیبروبلاست‌ها، کندروسیت‌ها، سلول‌های عضلانی، رتیکولوسیت‌ها، پلاکت‌ها.³
• منابع غیر انسانی: اگزوزوم‌ها یا وزیکول‌های شبه اگزوزوم از گیاهان و باکتری‌ها نیز گزارش شده‌اند.⁶⁴

به دلیل ترشح گسترده از سلول‌های مختلف، اگزوزوم‌ها در تقریباً تمام مایعات بدن انسان یافت می‌شوند، از جمله خون (پلاسما و سرم)، ادرار، بزاق، شیر مادر، مایع مغزی نخاعی (CSF)، مایع آمنیوتیک، مایع سینوویال (مفصلی)، مایع شستشوی برونکوآلوئولار (BALF)، مایع منی، مایع اپیدیدیمال، اشک و افیوژن‌های بدخیم (مانند آسیت).²

این منشأ سلولی متنوع، یک عامل کلیدی در تعیین محتوای مولکولی و در نتیجه عملکرد بیولوژیکی اگزوزوم‌ها است.¹ اگزوزوم‌های ترشح شده از سلول‌های مختلف، محموله‌های متفاوتی را حمل می‌کنند که منعکس‌کننده ویژگی‌ها و وضعیت آن سلول‌ها است. این ویژگی اساس پتانسیل اگزوزوم‌ها به عنوان نشانگرهای زیستی برای تشخیص بیماری‌ها (با شناسایی اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های بیمار) و همچنین راهنمای انتخاب منبع سلولی مناسب برای کاربردهای درمانی است. به عنوان مثال، خواص بازسازی‌کننده و تعدیل‌کننده ایمنی اگزوزوم‌های مشتق از MSC ها، آن‌ها را به گزینه‌های جذابی برای درمان بیماری‌های التهابی و دژنراتیو تبدیل کرده است ⁴⁸، در حالی که توانایی اگزوزوم‌های مشتق از DC ها در ارائه آنتی‌ژن، اساس استفاده بالقوه آن‌ها در واکسن‌های سرطانی است.⁵²

III. خصوصیات جامع اگزوزوم‌ها

برای درک کامل بیولوژی و پتانسیل کاربردی اگزوزوم‌ها، خصوصیات دقیق و چندوجهی آن‌ها ضروری است. این خصوصیات شامل ارزیابی ویژگی‌های مورفولوژیکی، اندازه، محتوای مولکولی و نشانگرهای سطحی می‌شود.

• A. ویژگی‌های مورفولوژیکی (تحلیل TEM، SEM، AFM)

تکنیک‌های میکروسکوپی با وضوح بالا ابزارهای اصلی برای تجسم و ارزیابی مورفولوژی اگزوزوم‌ها هستند.

1. میکروسکوپ الکترونی عبوری (Transmission Electron Microscopy – TEM): TEM به طور گسترده‌ای به عنوان “استاندارد طلایی” برای تأیید حضور وزیکول‌های غشادار در اندازه نانومتری و مشاهده مورفولوژی آن‌ها در نظر گرفته می‌شود.³
   • رنگ‌آمیزی منفی (Negative Staining): رایج‌ترین روش آماده‌سازی نمونه برای TEM است. در این روش، نمونه اگزوزوم روی یک شبکه پوشیده شده با فیلم نازک قرار داده شده و با یک محلول حاوی فلزات سنگین (مانند اورانیل استات) رنگ‌آمیزی می‌شود. این روش باعث می‌شود پس‌زمینه تیره شده و وزیکول‌ها به صورت ساختارهای روشن‌تر با ظاهری معمولاً “فنجانی شکل” (cup-shaped) یا دیسکی دیده شوند.⁵ این ظاهر فنجانی شکل احتمالاً یک آرتیفکت ناشی از فروریختن ساختار سه‌بعدی وزیکول در طی فرآیند خشک شدن نمونه است.
   • مقاطع فوق نازک (Ultrathin Sections): برای مشاهده ساختار داخلی اگزوزوم‌ها، نمونه‌ها ابتدا در رزین تثبیت و قالب‌گیری شده و سپس با اولترامیکروتوم به مقاطع بسیار نازک (حدود 60 نانومتر) برش داده می‌شوند. این مقاطع سپس رنگ‌آمیزی شده و زیر TEM مشاهده می‌شوند. این روش می‌تواند غشای دولایه لیپیدی و محتویات داخلی وزیکول را نشان دهد.⁵
   • ایمونولیبلینگ با طلا (Immuno-gold Labeling): این تکنیک امکان شناسایی و مکان‌یابی پروتئین‌های خاص را بر روی سطح یا درون اگزوزوم‌ها فراهم می‌کند. در این روش، از آنتی‌بادی‌های اختصاصی علیه پروتئین مورد نظر استفاده می‌شود که به ذرات نانومتری طلا متصل شده‌اند. این ذرات طلا به دلیل چگالی الکترونی بالا، به راحتی در تصاویر TEM قابل مشاهده هستند و مکان پروتئین هدف را مشخص می‌کنند.⁵ جزئیات دقیق پروتکل‌های آماده‌سازی نمونه برای TEM، شامل تثبیت با گلوتارآلدئید و اسمیم تتراکسید، آب‌گیری با استون، نفوذ رزین، مقطع‌گیری و رنگ‌آمیزی مضاعف با اورانیل استات و سیترات سرب، در منابع علمی شرح داده شده است.⁸⁶
2. میکروسکوپ الکترونی روبشی (Scanning Electron Microscopy – SEM): SEM برای تجسم مورفولوژی سطح سه‌بعدی اگزوزوم‌ها و بررسی توزیع اندازه و شکل آن‌ها در یک جمعیت استفاده می‌شود.³ SEM می‌تواند به تمایز اگزوزوم‌ها از وزیکول‌های بزرگتر یا توده‌های پروتئینی کمک کند.⁸⁴ انواع پیشرفته‌تر مانند SEM با انتشار میدانی (Field Emission SEM – FESEM) وضوح بالاتری را ارائه می‌دهند و می‌توانند جزئیات بیشتری از سطح وزیکول‌ها و حتی کانال‌های بین وزیکولی را آشکار کنند.⁹⁴ تصاویر FESEM اغلب اگزوزوم‌ها را به صورت ساختارهای کروی برجسته نشان می‌دهند.⁹⁴
3. میکروسکوپ نیروی اتمی (Atomic Force Microscopy – AFM): AFM یک تکنیک قدرتمند برای تصویربرداری با وضوح بالا از اگزوزوم‌های منفرد در شرایط نزدیک به فیزیولوژیکی است، زیرا نیازی به خلاء، تثبیت یا رنگ‌آمیزی ندارد.³ این روش از یک پروب بسیار ظریف برای “لمس” سطح نمونه و ایجاد یک نقشه توپوگرافی سه‌بعدی استفاده می‌کند.
   • AFM اطلاعات دقیقی در مورد اندازه، شکل، بافت سطح و همچنین خواص مکانیکی نانووزیکول‌ها مانند الاستیسیته، سختی و تغییر شکل‌پذیری (Deformability) ارائه می‌دهد.⁹⁴
   • مطالعات AFM نشان داده‌اند که اگزوزوم‌ها می‌توانند تحت نیروی اعمال شده توسط نوک AFM دچار تغییر شکل مکانیکی برگشت‌پذیر شوند، به این معنی که پس از برداشتن نیرو، تا حدی به شکل اولیه خود بازمی‌گردند.⁹⁴ این ویژگی الاستیک ممکن است در تعاملات آن‌ها با سلول‌ها یا عبور از فضاهای تنگ نقش داشته باشد.
   • AFM همچنین می‌تواند ساختارهای فرعی روی سطح اگزوزوم یا ناهمگونی در خواص سطح را آشکار کند که ممکن است به دلیل توزیع ناهمگون پروتئین‌ها یا لیپیدها باشد.⁹⁴

هر یک از این تکنیک‌های میکروسکوپی، دیدگاه منحصر به فردی را در مورد مورفولوژی اگزوزوم ارائه می‌دهند. TEM برای تأیید ساختار وزیکولی و مشاهده جزئیات داخلی یا مکان‌یابی پروتئین‌ها با ایمونولیبلینگ ایده‌آل است، اما می‌تواند به دلیل آماده‌سازی نمونه، آرتیفکت‌هایی مانند شکل فنجانی ایجاد کند. SEM نمای کلی خوبی از جمعیت و مورفولوژی سطح ارائه می‌دهد. AFM امکان مطالعه وزیکول‌های منفرد را در حالت طبیعی‌تر فراهم می‌کند و اطلاعات ارزشمندی در مورد خواص فیزیکی و مکانیکی آن‌ها به دست می‌دهد.⁵ بنابراین، استفاده ترکیبی از این روش‌ها، به همراه سایر تکنیک‌های خصوصیات، برای درک جامع و دقیق ویژگی‌های اگزوزوم‌ها ضروری است. خواص مکانیکی که توسط AFM آشکار می‌شوند، مانند تغییر شکل‌پذیری، فراتر از توصیف فیزیکی صرف هستند و احتمالاً با عملکرد بیولوژیکی اگزوزوم‌ها مرتبطند.⁹⁴ توانایی تغییر شکل ممکن است بر نحوه تعامل اگزوزوم با غشای سلول گیرنده (برای همجوشی یا اندوسیتوز)، پایداری آن در جریان خون یا توانایی آن برای نفوذ به بافت‌ها تأثیر بگذارد. این ارتباط بین خواص فیزیکی و عملکرد بیولوژیکی، یک حوزه تحقیقاتی مهم با پیامدهای بالقوه برای طراحی سیستم‌های تحویل داروی مبتنی بر اگزوزوم است.

• B. مشخصات اندازه (محدوده نانومتری) و مقایسه با گلبول‌های سفید خون (WBC)

اندازه یکی از پارامترهای کلیدی برای تعریف و خصوصیات اگزوزوم‌ها است.

• محدوده اندازه اگزوزوم: به طور کلی پذیرفته شده است که اگزوزوم‌ها وزیکول‌های نانومتری هستند. محدوده اندازه گزارش شده برای آن‌ها معمولاً بین 30 تا 150 نانومتر (nm) در قطر است.³ با این حال، محدوده‌های کمی متفاوت نیز در مقالات ذکر شده‌اند، مانند 30-100 نانومتر ¹⁴، 30-120 نانومتر ¹، 40-160 نانومتر ⁶ یا 30-200 نانومتر.¹¹ میانگین اندازه اگزوزوم‌ها اغلب حدود 100 نانومتر گزارش می‌شود.⁶
• تکنیک‌های اندازه‌گیری: چندین روش برای تعیین اندازه و توزیع اندازه اگزوزوم‌ها استفاده می‌شود:
  • آنالیز ردیابی نانوذرات (Nanoparticle Tracking Analysis – NTA): این روش حرکت براونی ذرات معلق در مایع را ردیابی کرده و با استفاده از رابطه استوکس-اینشتین، اندازه هیدرودینامیکی هر ذره را محاسبه می‌کند. NTA همچنین می‌تواند غلظت ذرات را بر حسب تعداد ذره در واحد حجم (مثلاً ذره/میلی‌لیتر) تخمین بزند.³ NTA یکی از رایج‌ترین روش‌ها برای خصوصیات EV ها است، اما محدودیت‌هایی دارد، از جمله حساسیت کمتر به ذرات بسیار کوچک (معمولاً کمتر از 50 نانومتر) و اندازه‌گیری قطر هیدرودینامیکی که بزرگتر از قطر فیزیکی واقعی وزیکول است.⁸²
  • پراکندگی نور دینامیکی (Dynamic Light Scattering – DLS): DLS نیز اندازه هیدرودینامیکی را بر اساس نوسانات شدت نور پراکنده شده توسط ذرات در حال حرکت براونی اندازه‌گیری می‌کند. این روش سریع و آسان است اما توزیع اندازه متوسط کل جمعیت را ارائه می‌دهد و به شدت تحت تأثیر حضور تعداد کمی ذرات بزرگتر یا تجمعات قرار می‌گیرد، بنابراین وضوح کمتری نسبت به NTA برای نمونه‌های ناهمگون دارد.³
  • میکروسکوپ الکترونی (TEM/SEM) و AFM: این روش‌ها می‌توانند اندازه فیزیکی وزیکول‌های منفرد را مستقیماً اندازه‌گیری کنند.¹ با این حال، اندازه‌گیری تعداد زیادی وزیکول برای به دست آوردن توزیع اندازه آماری می‌تواند زمان‌بر باشد و آماده‌سازی نمونه (به ویژه برای TEM) ممکن است بر اندازه تأثیر بگذارد.
• مقایسه اندازه با گلبول‌های سفید خون (WBCs): گلبول‌های سفید خون، که اجزای اصلی سیستم ایمنی سلولی هستند، به طور قابل توجهی بزرگتر از اگزوزوم‌ها می‌باشند. اندازه آن‌ها در مقیاس میکرومتر (µm) است، در حالی که اگزوزوم‌ها در مقیاس نانومتر هستند (1 میکرومتر = 1000 نانومتر).
  • اندازه WBC ها: انواع مختلف WBC اندازه های متفاوتی دارند: نوتروفیل‌ها حدود 10-12 میکرومتر، ائوزینوفیل‌ها 10-12 میکرومتر، بازوفیل‌ها 12-15 میکرومتر، لنفوسیت‌ها (بسته به نوع و وضعیت فعال‌سازی) 6-15 میکرومتر و مونوسیت‌ها 12-15 میکرومتر قطر دارند.⁸³ به طور کلی، اندازه WBC ها در محدوده 6 تا 15 میکرومتر (6000 تا 15000 نانومتر) قرار دارد.
  • مقایسه: با مقایسه این اندازه‌ها، مشخص می‌شود که WBC ها تقریباً 50 تا 150 برابر بزرگتر از اگزوزوم‌ها هستند (به عنوان مثال، یک مونوسیت 15 میکرومتری 150 برابر بزرگتر از یک اگزوزوم 100 نانومتری است). این تفاوت عظیم در مقیاس اندازه، اساس بسیاری از پروتکل‌های جداسازی اگزوزوم است که در مراحل اولیه، سلول‌ها (از جمله WBC ها) و بقایای سلولی بزرگتر را با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت پایین حذف می‌کنند.¹³

جدول 1: مقایسه اندازه اگزوزوم‌ها و گلبول‌های سفید خون (WBCs)

توجه: 1 میکرومتر (µm) = 1000 نانومتر (nm). اندازه‌ها تقریبی هستند و می‌توانند بسته به نوع سلول، وضعیت فعال‌سازی و روش اندازه‌گیری متفاوت باشند.

• غلظت اگزوزوم‌ها: اگزوزوم‌ها می‌توانند در غلظت‌های بسیار بالایی در مایعات بیولوژیکی وجود داشته باشند. اندازه‌گیری‌ها با NTA غلظت‌هایی در محدوده 10^9 تا 10^12 ذره در هر میلی‌لیتر را در پلاسما، سرم یا محیط کشت سلولی نشان داده‌اند.⁴⁰ غلظت در ادرار ممکن است متغیرتر باشد اما همچنان قابل توجه است.⁹⁷ این غلظت بالا، همراه با پایداری نسبی، به پتانسیل آن‌ها به عنوان نشانگرهای زیستی کمک می‌کند.

تنوع مشاهده شده در محدوده‌های اندازه گزارش‌شده برای اگزوزوم‌ها (مانند 30-100 نانومتر در مقابل 30-150 نانومتر) تنها ناشی از ناهمگونی بیولوژیکی ذاتی آن‌ها نیست.¹ بلکه منعکس‌کننده تفاوت در روش‌های اندازه‌گیری مورد استفاده (که هر کدام سوگیری‌ها و محدودیت‌های خود را دارند) ⁸²، احتمال هم‌پوشانی با سایر انواع EV های کوچک در آماده‌سازی‌های خالص‌نشده ¹⁰ و همچنین تکامل درک و تعریف اگزوزوم‌ها در طول زمان است. عدم وجود نشانگرهای مولکولی کاملاً منحصر به فرد که بتواند اگزوزوم‌ها را به طور قطعی از سایر EV های کوچک متمایز کند نیز به این ابهام می‌افزاید.² این موضوع اهمیت گزارش‌دهی دقیق و شفاف روش‌های جداسازی و خصوصیات مورد استفاده در هر مطالعه را برای امکان مقایسه نتایج و پیشرفت استانداردسازی در این زمینه برجسته می‌کند.

تفاوت فاحش در اندازه بین اگزوزوم‌ها (نانومتر) و سلول‌ها (میکرومتر) ¹³ دارای پیامدهای عملکردی مهمی است. اندازه بسیار کوچک اگزوزوم‌ها به آن‌ها اجازه می‌دهد تا به راحتی در مایعات بدن به گردش درآیند، از فضاهای بین سلولی عبور کنند و به طور بالقوه از موانع بیولوژیکی مهم مانند سد خونی-مغزی (Blood-Brain Barrier – BBB) عبور کنند.² علاوه بر این، اندازه نانومتری آن‌ها را برای جذب توسط سلول‌های گیرنده از طریق مسیرهای مختلف اندوسیتوزی مناسب می‌سازد. این ترکیب از تحرک، توانایی بالقوه عبور از سدها و جذب کارآمد سلولی، اندازه کوچک را به یک عامل کلیدی در نقش بیولوژیکی اگزوزوم‌ها به عنوان پیام‌رسان‌های بین سلولی و همچنین در پتانسیل آن‌ها به عنوان حامل‌های مؤثر برای تحویل هدفمند دارو تبدیل می‌کند.¹¹ در مقابل، اندازه بزرگ سلول‌ها مانع از چنین توزیع گسترده و عبور از سدها می‌شود.

• C. محموله مولکولی (پروتئین‌ها، لیپیدها، اسیدهای نوکلئیک)

اگزوزوم‌ها حامل محموله مولکولی متنوعی هستند که از سلول والد به ارث می‌برند و شامل دسته‌های اصلی زیر می‌شوند:

1. پروتئین‌ها: اگزوزوم‌ها حاوی صدها یا حتی هزاران نوع پروتئین مختلف هستند.¹⁹ این پروتئین‌ها را می‌توان به چند دسته تقسیم کرد:
   • پروتئین‌های غشایی: این پروتئین‌ها در غشای دولایه لیپیدی اگزوزوم قرار دارند و شامل موارد زیر هستند:
     • تتراسپانین‌ها: مانند CD9، CD63 و CD81 که به طور فراوان در اگزوزوم‌ها یافت می‌شوند و به عنوان نشانگرهای رایج برای شناسایی و جداسازی آن‌ها به کار می‌روند.⁷
     • مولکول‌های چسبندگی سلولی: مانند اینتگرین‌ها که ممکن است در هدف‌گیری اگزوزوم به سلول‌های خاص نقش داشته باشند.⁹
     • گیرنده‌ها: گیرنده‌های مختلفی که از سلول والد به ارث رسیده‌اند.
     • مولکول‌های مجموعه سازگاری بافتی اصلی (MHC): مولکول‌های MHC کلاس I و II که در ارائه آنتی‌ژن نقش دارند و در اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های ارائه‌دهنده آنتی‌ژن یافت می‌شوند.⁹
   • پروتئین‌های سیتوزولی و مرتبط با بیوژنز: این پروتئین‌ها در لومن اگزوزوم یا متصل به سطح داخلی غشاء یافت می‌شوند و اغلب در فرآیند تشکیل اگزوزوم نقش دارند:
     • پروتئین‌های ماشین ESCRT: مانند Alix و TSG101.⁷
     • پروتئین‌های شاک حرارتی (Heat Shock Proteins): مانند Hsp70 و Hsp90 که در تاخوردگی پروتئین‌ها و پاسخ به استرس نقش دارند.⁷
     • پروتئین‌های اسکلت سلولی: مانند اکتین و توبولین.
     • پروتئین‌های انتقال غشاء: مانند انکسین‌ها (Annexins) و Rab GTPases.⁷
   • سایر پروتئین‌های عملکردی: اگزوزوم‌ها می‌توانند حاوی آنزیم‌ها، فاکتورهای رشد، سیتوکین‌ها و سایر پروتئین‌هایی باشند که عملکرد سلول والد را منعکس می‌کنند و می‌توانند بر سلول گیرنده تأثیر بگذارند.³ پایگاه‌های داده آنلاین مانند ExoCarta و Vesiclepedia فهرست جامعی از پروتئین‌های شناسایی شده در اگزوزوم‌ها را ارائه می‌دهند.²⁰
2. لیپیدها: غشای اگزوزوم دارای ترکیب لیپیدی منحصر به فردی است که با غشای پلاسمایی سلول والد تفاوت دارد. اگزوزوم‌ها به طور مشخصی غنی از لیپیدهای خاصی هستند، از جمله:
   • کلسترول.³
   • اسفنگومیلین.⁶
   • سرامید.⁶
   • فسفاتیدیل سرین (Phosphatidylserine – PS): که معمولاً در لایه داخلی غشای پلاسمایی قرار دارد اما ممکن است در سطح اگزوزوم‌ها نیز وجود داشته باشد.¹⁰ این ترکیب لیپیدی خاص بر خواص فیزیکی غشای اگزوزوم مانند سیالیت، انحنا و پایداری تأثیر می‌گذارد و همچنین در فرآیندهای بیوژنز، آزادسازی و تعامل با سلول‌های گیرنده نقش دارد.¹⁰
3. اسیدهای نوکلئیک: اگزوزوم‌ها حامل انواع مختلفی از اسیدهای نوکلئیک هستند که می‌توانند به سلول‌های گیرنده منتقل شده و عملکرد آن‌ها را تحت تأثیر قرار دهند:
   • RNA: طیف وسیعی از مولکول‌های RNA در اگزوزوم‌ها یافت شده است، از جمله:
     • RNA پیام‌رسان (mRNA): که می‌تواند در سلول گیرنده به پروتئین ترجمه شود.³
     • میکرو RNA (miRNA): مولکول‌های کوچک RNA غیرکدکننده که نقش مهمی در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی دارند.⁶
     • سایر RNA های غیرکدکننده: مانند RNA های طویل غیرکدکننده (lncRNA)، RNA های دایره‌ای (circRNA)، RNA های انتقالی (tRNA)، RNA های ریبوزومی (rRNA) و سایر RNA های کوچک.³
   • DNA: حضور DNA در اگزوزوم‌ها نیز گزارش شده است، اگرچه ممکن است به اندازه RNA فراوان نباشد. این شامل DNA میتوکندریایی (mtDNA) و قطعاتی از DNA ژنومی، هم به صورت تک‌رشته‌ای (ssDNA) و هم دورشته‌ای (dsDNA) می‌شود.³ یکی از ویژگی‌های مهم محموله اسید نوکلئیک اگزوزوم‌ها این است که در داخل وزیکول در برابر آنزیم‌های نوکلئاز موجود در محیط خارج سلولی (مانند RNase ها و DNase ها) محافظت می‌شوند.¹¹ این پایداری برای عملکرد آن‌ها در انتقال اطلاعات ژنتیکی به سلول‌های دیگر و همچنین برای استفاده از آن‌ها به عنوان نشانگرهای زیستی در مایعات بدن بسیار حیاتی است، زیرا امکان تشخیص اسیدهای نوکلئیک مرتبط با بیماری را فراهم می‌کند. RNA های منتقل شده توسط اگزوزوم‌ها می‌توانند در سلول گیرنده فعال باشند و با تأثیر بر ترجمه پروتئین یا سایر مسیرهای سلولی، بیان ژن و عملکرد سلول را تعدیل کنند.³
4. سایر مولکول‌ها: علاوه بر پروتئین‌ها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئیک، اگزوزوم‌ها می‌توانند حاوی مولکول‌های کوچک دیگری مانند متابولیت‌ها و اسیدهای آمینه نیز باشند که ممکن است در سیگنال‌دهی نقش داشته باشند.⁶

ترکیب مولکولی پیچیده و متنوع اگزوزوم‌ها ³ اساس عملکردهای چندگانه آن‌ها در ارتباطات بین سلولی است. آن‌ها صرفاً حامل‌های منفعل نیستند، بلکه بسته‌های اطلاعاتی متراکمی هستند که می‌توانند به طور همزمان سیگنال‌های متعددی را از طریق پروتئین‌ها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئیک به سلول گیرنده تحویل دهند. این انتقال چندوجهی اطلاعات، اگزوزوم‌ها را قادر می‌سازد تا تغییرات پیچیده و ظریفی را در فنوتیپ و رفتار سلول گیرنده القا کنند، که این امر آن‌ها را از مکانیسم‌های سیگنال‌دهی ساده‌تر مانند برهمکنش یک لیگاند با یک گیرنده متمایز می‌کند.

حفاظت از محموله، به ویژه اسیدهای نوکلئیک، در برابر تخریب در محیط خارج سلولی ¹¹ یک ویژگی کلیدی است. این پایداری ذاتی که توسط غشای لیپیدی اگزوزوم فراهم می‌شود، نه تنها برای انتقال موفقیت‌آمیز اطلاعات ژنتیکی به سلول‌های هدف ضروری است، بلکه اساس پتانسیل اگزوزوم‌ها به عنوان ابزارهای تشخیصی در بیوپسی مایع را تشکیل می‌دهد. این پایداری اجازه می‌دهد تا RNA ها و DNA های خاص بیماری که توسط سلول‌های بیمار در اگزوزوم‌ها بسته‌بندی شده‌اند، در مایعات بدن مانند خون یا ادرار شناسایی شوند، حتی اگر خود سلول‌های بیمار به راحتی قابل دسترس نباشند.

• D. نشانگرهای سطحی مشخصه (تتراسپانین‌ها و غیره)

شناسایی و خصوصیات اگزوزوم‌ها تا حد زیادی به تشخیص نشانگرهای پروتئینی خاص که در سطح یا داخل آن‌ها وجود دارند، متکی است.

• نشانگرهای مثبت رایج:
  • تتراسپانین‌ها (Tetraspanins): این خانواده از پروتئین‌های غشایی چهار بار عبور کننده، به ویژه CD9، CD63 و CD81، به طور فراوان در غشای اگزوزوم‌ها یافت می‌شوند و به طور گسترده‌ای به عنوان نشانگرهای استاندارد برای شناسایی، جداسازی (به عنوان مثال، از طریق ایمونوافیتی) و تأیید خلوص آماده‌سازی‌های اگزوزومی استفاده می‌شوند.⁷ سایر تتراسپانین‌ها مانند CD82 و CD151 نیز در اگزوزوم‌ها گزارش شده‌اند.³¹
  • پروتئین‌های مرتبط با بیوژنز MVB/ILV: پروتئین‌های دخیل در مسیر ESCRT مانند Alix (همچنین به عنوان PDCD6IP شناخته می‌شود) و TSG101 (Tumor Susceptibility Gene 101) اغلب در اگزوزوم‌ها غنی هستند و به عنوان نشانگرهای داخلی (لومنال یا مرتبط با غشاء) استفاده می‌شوند.⁷
  • سایر پروتئین‌های غشایی یا مرتبط با غشاء: پروتئین‌های دخیل در انتقال غشاء مانند انکسین‌ها (Annexins) و پروتئین‌های Rab، پروتئین‌های شاک حرارتی (مانند Hsp70)، مولکول‌های MHC (به ویژه در اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های ایمنی) و اینتگرین‌ها نیز معمولاً در اگزوزوم‌ها یافت می‌شوند.⁷
• نشانگرهای منفی: برای تأیید خلوص آماده‌سازی اگزوزوم و اطمینان از عدم آلودگی با سایر اجزای سلولی، بررسی عدم وجود یا سطح پایین پروتئین‌های خاص سایر اندامک‌ها مهم است. این نشانگرهای منفی معمولاً شامل موارد زیر هستند ⁷:
  • شبکه آندوپلاسمی (ER): کالنکسین (Calnexin)، GRP94.
  • دستگاه گلژی: GM130.
  • میتوکندری: سیتوکروم C (Cytochrome C).
  • هسته: هیستون‌ها (Histones)، Lamin A/C.
  • لیزوزوم: LAMP1/2 (اگرچه ممکن است در MVB ها نیز وجود داشته باشند).

یک نکته مهم این است که در حالی که تتراسپانین‌ها و پروتئین‌های ESCRT به طور معمول به عنوان “نشانگرهای اگزوزوم” استفاده می‌شوند، هیچ نشانگر پروتئینی منفردی که به طور انحصاری و قطعی فقط در اگزوزوم‌ها یافت شود، شناسایی نشده است.⁷ بسیاری از این پروتئین‌ها می‌توانند در انواع دیگر EV ها، به ویژه میکرووزیکول‌ها، نیز وجود داشته باشند (به عنوان مثال، CD9 و CD81 در اکتوزوم‌ها نیز فراوان هستند ³⁰) یا در سطوح پایین در خود سلول والد بیان شوند. بنابراین، رویکرد توصیه شده توسط جامعه علمی (مانند دستورالعمل‌های MISEV) برای خصوصیات قابل اعتماد اگزوزوم‌ها، استفاده از ترکیبی از نشانگرها است: تشخیص حداقل سه نشانگر مثبت مختلف که نماینده دسته‌های متفاوتی هستند (به عنوان مثال، حداقل یک پروتئین تتراسپانین غشایی مانند CD63 یا CD81، و حداقل یک پروتئین سیتوزولی یا مرتبط با بیوژنز مانند Alix یا TSG101) به همراه تأیید عدم وجود یا سطح بسیار پایین حداقل یک نشانگر منفی از اندامک‌های غیر مرتبط (مانند کالنکسین).¹⁰ این رویکرد چند نشانگری به تأیید غنی‌سازی برای اگزوزوم‌ها و ارزیابی خلوص آماده‌سازی کمک می‌کند.

IV. نقش‌ها و عملکردهای بیولوژیکی

اگزوزوم‌ها به عنوان بازیگران کلیدی در بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی، هم در سلامت و هم در بیماری، شناخته می‌شوند. عملکرد اصلی آن‌ها از طریق میانجی‌گری در ارتباطات بین سلولی و انتقال محموله‌های مولکولی صورت می‌گیرد.

• A. مکانیسم‌های ارتباط بین سلولی

اگزوزوم‌ها به عنوان وسایل نقلیه طبیعی برای انتقال اطلاعات مولکولی بین سلول‌ها عمل می‌کنند. این ارتباط می‌تواند بین سلول‌های مجاور در یک بافت (ارتباط پاراکرین) یا بین سلول‌ها در اندام‌های مختلف از طریق گردش خون یا سایر مایعات بدن (ارتباط اندوکرین یا سیستمیک) رخ دهد.¹

این ارتباط از طریق تحویل محموله متنوع اگزوزوم‌ها (شامل پروتئین‌های عملکردی، لیپیدهای سیگنال‌دهنده و انواع مختلف RNA های تنظیم‌کننده) به سلول‌های گیرنده انجام می‌شود.³ پس از رسیدن به سلول هدف، اگزوزوم‌ها می‌توانند از طریق مکانیسم‌های مختلفی با آن تعامل کرده و محموله خود را تحویل دهند:

1. همجوشی مستقیم غشاء: غشای لیپیدی اگزوزوم مستقیماً با غشای پلاسمایی سلول گیرنده همجوشی پیدا کرده و محتویات لومن اگزوزوم را به سیتوزول سلول هدف آزاد می‌کند.¹¹
2. اندوسیتوز: اگزوزوم‌ها توسط سلول گیرنده از طریق مسیرهای مختلف اندوسیتوزی، مانند اندوسیتوز وابسته به کلاترین، اندوسیتوز وابسته به کاوئولین، فاگوسیتوز (توسط سلول‌های فاگوسیت کننده) یا ماکروپینوسیتوز، به داخل سلول بلعیده می‌شوند.²² پس از ورود به سیستم اندوزومی سلول گیرنده، اگزوزوم‌ها ممکن است با غشای اندوزوم همجوشی پیدا کرده و محموله خود را به سیتوزول آزاد کنند یا از اندوزوم فرار کرده و به سیتوزول برسند. مسیر دقیق اندوسیتوز ممکن است به نوع سلول گیرنده و مولکول‌های سطحی اگزوزوم بستگی داشته باشد.
3. تعامل لیگاند-گیرنده: پروتئین‌ها یا لیپیدهای موجود بر روی سطح اگزوزوم می‌توانند به عنوان لیگاند عمل کرده و به گیرنده‌های مکمل روی سطح سلول هدف متصل شوند. این اتصال می‌تواند بدون نیاز به ورود کامل اگزوزوم به سلول، مسیرهای سیگنال‌دهی پایین‌دستی را در سلول گیرنده فعال کند.¹¹

صرف نظر از مکانیسم دقیق، نتیجه نهایی این تعامل، تعدیل فنوتیپ و عملکرد سلول گیرنده است. محموله منتقل شده می‌تواند بر فرآیندهای سلولی متنوعی مانند تکثیر سلولی، مهاجرت، تمایز، مرگ برنامه‌ریزی شده (آپوپتوز)، پاسخ به استرس، رگ‌زایی و بیان ژن تأثیر بگذارد.⁵

• B. اهمیت فیزیولوژیکی (ایمنی، ترمیم، هموستاز)

ارتباطات بین سلولی با واسطه اگزوزوم‌ها نقش‌های حیاتی در حفظ هموستاز بافتی و عملکرد طبیعی اندام‌ها ایفا می‌کند:

• تنظیم سیستم ایمنی: اگزوزوم‌ها در تنظیم پاسخ‌های ایمنی ذاتی و اکتسابی نقش دارند. به عنوان مثال، اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های ارائه‌دهنده آنتی‌ژن (مانند سلول‌های دندریتیک) که حامل کمپلکس‌های پپتید-MHC هستند، می‌توانند سلول‌های T را فعال کنند.³ از سوی دیگر، اگزوزوم‌ها می‌توانند با انتقال مولکول‌های سرکوب‌کننده ایمنی، پاسخ‌های ایمنی را مهار کنند. این نقش دوگانه در فعال‌سازی و سرکوب ایمنی، آن‌ها را به بازیگران مهمی در شرایط التهابی، بیماری‌های خودایمنی و ایمنی تومور تبدیل می‌کند.³
• ترمیم و بازسازی بافت: اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های بنیادی، به ویژه MSC ها، به عنوان عوامل کلیدی در اثرات پاراکرین این سلول‌ها شناخته می‌شوند. این اگزوزوم‌ها حاوی فاکتورهای رشد، سیتوکین‌ها، miRNA ها و سایر مولکول‌هایی هستند که می‌توانند باعث بهبود زخم، بازسازی استخوان و غضروف، محافظت از سلول‌های عصبی در برابر آسیب، و تحریک رگ‌زایی (تشکیل عروق خونی جدید) شوند.¹⁵ این ویژگی‌ها پتانسیل درمانی عظیمی را برای اگزوزوم‌های MSC در پزشکی بازساختی ایجاد کرده است.
• هموستاز و عملکرد اندام‌ها: اگزوزوم‌ها در حفظ تعادل فیزیولوژیکی نقش دارند. به عنوان مثال، در انعقاد خون ⁴¹، حفظ سلامت و عملکرد اعصاب محیطی از طریق ارتباط بین سلول‌های شوان و آکسون‌ها ²⁶ و ارتباط متقابل بین اندام‌های مختلف برای هماهنگی عملکردهای بدن نقش دارند.⁴ همچنین، نقش اولیه پیشنهاد شده برای اگزوزوم‌ها به عنوان وسیله‌ای برای دفع مولکول‌های غیرضروری یا آسیب‌دیده از سلول، ممکن است همچنان در حفظ هموستاز سلولی نقش داشته باشد.³
• رشد مو و سلامت پوست: تحقیقات نشان داده‌اند که اگزوزوم‌ها، به ویژه آن‌هایی که از MSC ها یا سلول‌های پاپیلای پوستی مشتق می‌شوند، می‌توانند با تحریک سلول‌های فولیکول مو، باعث رشد موهای جدید و افزایش ضخامت مو شوند.⁴² در پوست، اگزوزوم‌ها می‌توانند تولید کلاژن و الاستین را توسط فیبروبلاست‌ها افزایش دهند، التهاب را کاهش دهند، به بهبود لکه‌های تیره (هایپرپیگمنتیشن) کمک کنند و در ترمیم آسیب‌های پوستی نقش داشته باشند.³³
• C. دخالت در پاتوژنز بیماری

علاوه بر نقش‌های فیزیولوژیکی، اگزوزوم‌ها به طور فزاینده‌ای به عنوان عوامل مؤثر در پیشرفت بیماری‌های مختلف شناخته می‌شوند:

• سرطان: اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های توموری (Tumor-Derived Exosomes – TDEs) نقش‌های چندگانه‌ای در تمام مراحل پیشرفت سرطان ایفا می‌کنند:
  • رشد و بقای تومور: انتقال فاکتورهای رشد، مولکول‌های سیگنال‌دهنده و miRNA های انکوژنیک که تکثیر و بقای سلول‌های سرطانی را تحریک می‌کنند.⁶
  • رگ‌زایی (Angiogenesis): تحریک تشکیل عروق خونی جدید برای تغذیه تومور.³
  • تهاجم و متاستاز: تسهیل تهاجم سلول‌های سرطانی به بافت‌های اطراف و گسترش آن‌ها به نقاط دوردست بدن (متاستاز) از طریق انتقال پروتئازها، مولکول‌های مؤثر بر ماتریکس خارج سلولی و القای تغییرات اپیتلیال به مزانشیمی (EMT).³
  • تعدیل ریزمحیط تومور (Tumor Microenvironment – TME): TDEs می‌توانند با سلول‌های استرومایی (مانند فیبروبلاست‌های مرتبط با سرطان – CAFs) و سلول‌های ایمنی در TME تعامل کرده و محیطی را ایجاد کنند که از رشد تومور حمایت می‌کند. این شامل سرکوب پاسخ‌های ایمنی ضد تومور از طریق انتقال مولکول‌های سرکوب‌کننده ایمنی (مانند PD-L1) یا القای تمایز سلول‌های ایمنی سرکوب‌گر است.⁶
  • مقاومت دارویی: انتقال مولکول‌هایی (مانند پروتئین‌های پمپ‌کننده دارو یا miRNA ها) که باعث مقاومت سلول‌های سرطانی به شیمی‌درمانی یا سایر درمان‌ها می‌شوند.⁶
  • القای تغییرات نئوپلاستیک: در برخی موارد، TDEs ممکن است بتوانند تغییرات پیش‌سرطانی را در سلول‌های طبیعی القا کنند.⁶
• بیماری‌های نورودژنراتیو: در بیماری‌هایی مانند آلزایمر، پارکینسون و بیماری هانتینگتون، اگزوزوم‌ها به عنوان یکی از مکانیسم‌های احتمالی برای انتشار پروتئین‌های تاشده نادرست و سمی (مانند آمیلوئید بتا، تاو هیپرفسفریله شده و آلفا-سینوکلئین) بین سلول‌های عصبی مطرح شده‌اند. این انتشار می‌تواند به گسترش پاتولوژی در سراسر مغز کمک کند.¹ اگزوزوم‌ها همچنین ممکن است در فرآیندهای التهاب عصبی (Neuroinflammation) که در این بیماری‌ها نقش دارند، دخیل باشند.²⁶ از سوی دیگر، توانایی اگزوزوم‌ها برای عبور از سد خونی-مغزی، آن‌ها را به ابزارهای بالقوه‌ای برای تشخیص زودهنگام این بیماری‌ها از طریق تجزیه و تحلیل مایع مغزی نخاعی یا حتی خون تبدیل کرده است.²
• بیماری‌های قلبی-عروقی (Cardiovascular Diseases – CVDs): اگزوزوم‌ها در پاتوفیزیولوژی بیماری‌های مختلف قلبی-عروقی، از جمله تصلب شرایین (آترواسکلروزیس)، انفارکتوس میوکارد (سکته قلبی)، آریتمی‌ها و نارسایی قلبی نقش دارند. آن‌ها می‌توانند در فرآیندهایی مانند التهاب عروقی، عملکرد اندوتلیال، بازآرایی قلبی و پاسخ به آسیب ایسکمیک دخالت داشته باشند.¹ محتوای اگزوزوم‌های در گردش ممکن است وضعیت پاتولوژیک قلب و عروق را منعکس کند و به عنوان نشانگر زیستی عمل کند.⁶⁶
• بیماری‌های التهابی و عفونی: اگزوزوم‌ها می‌توانند پاسخ‌های التهابی را تعدیل کنند (هم تقویت و هم تضعیف) و در پاتوژنز بیماری‌های التهابی مزمن نقش داشته باشند.¹ در بیماری‌های عفونی، اگزوزوم‌ها می‌توانند توسط سلول‌های آلوده (مثلاً به ویروس) آزاد شوند و حاوی اجزای پاتوژن (مانند پروتئین‌ها یا RNA های ویروسی) باشند که می‌توانند به سلول‌های دیگر منتقل شده و پاسخ ایمنی را تحت تأثیر قرار دهند یا حتی به گسترش عفونت کمک کنند.⁴¹

نقش دوگانه اگزوزوم‌ها در بسیاری از بیماری‌ها، به ویژه در سرطان، بسیار قابل توجه است. در حالی که اگزوزوم‌های مشتق از تومور می‌توانند به شدت پیشرفت بیماری را تسریع کنند ³، اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های دیگر (مانند سلول‌های ایمنی یا بنیادی) یا اگزوزوم‌های مهندسی شده، پتانسیل استفاده به عنوان ابزار درمانی را دارند (مانند واکسن‌های اگزوزومی یا حامل‌های دارو).³⁸ این دوگانگی نشان می‌دهد که عملکرد اگزوزوم به شدت وابسته به زمینه (نوع سلول مبدأ، وضعیت سلول، محموله خاص) است و درک دقیق این عوامل برای بهره‌برداری درمانی از اگزوزوم‌ها یا مهار اثرات مضر آن‌ها ضروری است.

اساساً، توانایی اگزوزوم‌ها برای بسته‌بندی و انتقال مولکول‌های عملکردی که می‌توانند فنوتیپ و رفتار سلول گیرنده را تغییر دهند ³، مکانیسم محوری است که هم نقش‌های فیزیولوژیکی و هم پاتولوژیکی آن‌ها را توضیح می‌دهد. همین مکانیسم انتقال محموله است که پتانسیل درمانی آن‌ها را به عنوان سیستم‌های تحویل طبیعی برای مولکول‌های درمانی (مانند RNA ها یا پروتئین‌ها) یا به عنوان منبع سیگنال‌های بازسازی‌کننده (در مورد اگزوزوم‌های MSC) ایجاد می‌کند و همزمان توضیح می‌دهد که چگونه سیگنال‌های بیماری‌زا (مانند پروتئین‌های تاشده نادرست یا انکوژن‌ها) می‌توانند از طریق اگزوزوم‌ها منتشر شوند.

V. روش‌شناسی در تحقیقات اگزوزوم

پیشرفت در درک بیولوژی و کاربردهای اگزوزوم‌ها به شدت به توسعه و استانداردسازی روش‌های جداسازی، خالص‌سازی، کمی‌سازی و خصوصیات آن‌ها وابسته است.

• A. استراتژی‌های جداسازی و خالص‌سازی

جداسازی اگزوزوم‌ها از نمونه‌های بیولوژیکی پیچیده (مانند مایعات بدن یا محیط کشت سلولی) که حاوی انواع مختلفی از سلول‌ها، وزیکول‌ها، پروتئین‌ها و سایر مولکول‌ها هستند، یک چالش اساسی است. روش‌های مختلفی برای این منظور توسعه یافته‌اند که هر کدام بر اساس اصول فیزیکی یا شیمیایی متفاوتی عمل می‌کنند:

1. اولتراسانتریفیوژ افتراقی (Differential Ultracentrifugation – UC): این روش به عنوان روش کلاسیک و متداول‌ترین تکنیک برای جداسازی اگزوزوم‌ها در نظر گرفته می‌شود و گاهی “استاندارد طلایی” نامیده می‌شود.⁹ این روش شامل چندین مرحله سانتریفیوژ با سرعت‌های افزایشی است: ابتدا سانتریفیوژ با سرعت پایین (مانند 300-2000 x g) برای حذف سلول‌های زنده و مرده، سپس با سرعت متوسط (مانند 10,000-20,000 x g) برای حذف بقایای سلولی بزرگتر و اجسام آپوپتوتیک، و در نهایت یک یا چند مرحله اولتراسانتریفیوژ با سرعت بسیار بالا (معمولاً 100,000 x g یا بیشتر) برای رسوب دادن وزیکول‌های کوچکتر مانند اگزوزوم‌ها و میکرووزیکول‌ها.⁹
   • مزایا: قابلیت پردازش حجم‌های نسبتاً بزرگ نمونه، عدم نیاز به معرف‌های خاص، به طور گسترده در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی استفاده می‌شود.⁹⁹
   • معایب: فرآیندی طولانی و زمان‌بر (چندین ساعت)، نیاز به تجهیزات گران‌قیمت (اولتراسانتریفیوژ)، بازده نسبتاً پایین، احتمال آسیب مکانیکی به وزیکول‌ها یا ایجاد تجمع (aggregation) به دلیل نیروهای گریز از مرکز بالا، و خلوص متوسط، زیرا ممکن است پروتئین‌های محلول، لیپوپروتئین‌ها یا سایر انواع EV ها همراه با اگزوزوم‌ها رسوب کنند.⁹
2. سانتریفیوژ گرادیان چگالی (Density Gradient Centrifugation): این روش اغلب پس از یک مرحله اولتراسانتریفیوژ اولیه برای افزایش خلوص اگزوزوم‌ها استفاده می‌شود. نمونه در بالای یک گرادیان چگالی (معمولاً از ساکارز یا یدیکسانول) قرار داده شده و با سرعت بالا سانتریفیوژ می‌شود. اگزوزوم‌ها بر اساس چگالی شناور منحصر به فرد خود (معمولاً در محدوده 1.08 تا 1.22 گرم در میلی‌لیتر) در گرادیان به تعادل می‌رسند و از سایر ذرات با چگالی متفاوت (مانند پروتئین‌ها یا لیپوپروتئین‌ها) جدا می‌شوند.⁹
   • مزایا: دستیابی به خلوص بالا، جداسازی مؤثر از آلاینده‌های غیر وزیکولی.⁸³
   • معایب: فرآیندی فنی و زمان‌بر، بازده ممکن است پایین باشد، احتمال آسیب به وزیکول‌ها به دلیل نیروهای گریز از مرکز بالا و اسمولاریته بالای محیط گرادیان.⁹⁹
3. کروماتوگرافی حذف اندازه (Size Exclusion Chromatography – SEC): این روش جداسازی را بر اساس اندازه مولکول‌ها یا ذرات انجام می‌دهد. نمونه از ستونی عبور داده می‌شود که با یک ماده متخلخل پر شده است. ذرات بزرگتر از اندازه منافذ (مانند اگزوزوم‌ها) نمی‌توانند وارد منافذ شوند و سریعتر از ستون خارج می‌شوند (در حجم مرده یا void volume)، در حالی که مولکول‌های کوچکتر (مانند پروتئین‌های محلول) وارد منافذ شده و دیرتر خارج می‌شوند.⁹
   • مزایا: روشی ملایم که ساختار، یکپارچگی و فعالیت بیولوژیکی اگزوزوم‌ها را حفظ می‌کند، نسبتاً سریع و ساده است، نیاز به تجهیزات خاصی ندارد (به جز ستون و پمپ)، و می‌تواند خلوص خوبی را به خصوص در ترکیب با روش‌های دیگر (مانند اولترافیلتراسیون برای تغلیظ اولیه) ارائه دهد.⁹
   • معایب: نمونه حاصل معمولاً رقیق است و نیاز به تغلیظ دارد، ممکن است قادر به جداسازی کامل اگزوزوم‌ها از سایر ذرات هم‌اندازه مانند لیپوپروتئین‌ها یا ویروس‌ها نباشد، و مقیاس‌پذیری آن برای پردازش حجم‌های بسیار بزرگ نمونه ممکن است محدود باشد.⁹
4. رسوب‌گذاری مبتنی بر پلیمر (Polymer-based Precipitation): در این روش‌ها از پلیمرهای آب‌دوست و حجم‌گیر مانند پلی‌اتیلن گلیکول (PEG) استفاده می‌شود. این پلیمرها با جذب مولکول‌های آب، حلالیت اگزوزوم‌ها و سایر ماکرومولکول‌ها را کاهش داده و باعث رسوب آن‌ها می‌شوند. رسوب حاصل سپس با یک سانتریفیوژ با سرعت پایین جمع‌آوری می‌شود.¹⁹ بسیاری از کیت‌های تجاری برای جداسازی اگزوزوم بر این اساس کار می‌کنند.¹⁰⁰
   • مزایا: روشی بسیار سریع (اغلب نیاز به یک انکوباسیون کوتاه و یک مرحله سانتریفیوژ)، آسان برای استفاده، بدون نیاز به تجهیزات تخصصی مانند اولتراسانتریفیوژ، و معمولاً بازده بالایی از نظر مقدار کل پروتئین یا تعداد ذرات دارد.⁹⁹
   • معایب: خلوص محصول نهایی معمولاً پایین است، زیرا پلیمرها باعث رسوب مشترک بسیاری از پروتئین‌های محلول، لیپوپروتئین‌ها و سایر ماکرومولکول‌های موجود در نمونه می‌شوند. این آلاینده‌ها می‌توانند در آنالیزهای پایین‌دستی تداخل ایجاد کنند یا بر فعالیت بیولوژیکی اگزوزوم‌ها تأثیر بگذارند.¹⁹
5. اولترافیلتراسیون (Ultrafiltration – UF): این تکنیک از غشاهایی با اندازه منافذ مشخص (Membrane filters with defined pore sizes) یا فیلترهای قطع وزن مولکولی (Molecular Weight Cut-Off – MWCO) استفاده می‌کند. با اعمال فشار یا نیروی گریز از مرکز، مایع و مولکول‌های کوچکتر از اندازه منافذ از غشاء عبور می‌کنند، در حالی که ذرات بزرگتر مانند اگزوزوم‌ها در بالای غشاء باقی مانده و تغلیظ می‌شوند.⁹ اولترافیلتراسیون اغلب به عنوان یک مرحله اولیه برای حذف مولکول‌های کوچک یا تغلیظ نمونه قبل از استفاده از روش‌های دیگر (مانند SEC یا گرادیان چگالی) یا به عنوان روش اصلی در ترکیب با سانتریفیوژ افتراقی استفاده می‌شود.⁹
   • مزایا: روشی نسبتاً ساده و سریع برای تغلیظ نمونه یا حذف آلاینده‌های کوچک.⁹
   • معایب: به تنهایی خلوص بالایی ارائه نمی‌دهد، احتمال مسدود شدن منافذ غشاء وجود دارد، و نیروی برشی اعمال شده در طی فیلتراسیون ممکن است به ساختار وزیکول‌ها آسیب برساند یا باعث تجمع آن‌ها شود.⁹
6. جداسازی مبتنی بر ایمونوافیتی (Immunoaffinity Capture – IAC): این روش از میل ترکیبی بالای آنتی‌بادی‌ها به نشانگرهای پروتئینی خاص در سطح اگزوزوم‌ها (مانند CD9، CD63، CD81 یا سایر نشانگرهای خاص سلول) بهره می‌برد. آنتی‌بادی‌ها به یک بستر جامد مانند دانه‌های مغناطیسی (magnetic beads)، ستون‌های کروماتوگرافی یا سطح چاهک‌های میکروپلیت متصل می‌شوند. هنگامی که نمونه حاوی اگزوزوم از روی این بستر عبور داده می‌شود یا با آن انکوبه می‌شود، اگزوزوم‌های دارای نشانگر هدف به آنتی‌بادی‌ها متصل شده و به دام می‌افتند، در حالی که سایر اجزا شسته می‌شوند.¹⁶
   • مزایا: پتانسیل دستیابی به خلوص بسیار بالا، توانایی جداسازی زیرجمعیت‌های خاصی از اگزوزوم‌ها بر اساس بیان نشانگر سطحی آن‌ها.
   • معایب: هزینه نسبتاً بالا به دلیل نیاز به آنتی‌بادی‌های اختصاصی، ظرفیت اتصال محدود بستر که ممکن است بازده را کاهش دهد، احتمال انتخاب سوگیرانه جمعیت اگزوزوم (فقط آن‌هایی که نشانگر هدف را بیان می‌کنند جدا می‌شوند)، و نیاز به یک مرحله الوشن (elution) برای آزادسازی اگزوزوم‌های متصل شده که ممکن است بر یکپارچگی یا عملکرد آن‌ها تأثیر بگذارد.
7. روش‌های مبتنی بر میکروفلوئیدیک (Microfluidic-based Methods): این‌ها تکنیک‌های نوظهوری هستند که از دستگاه‌هایی با کانال‌های میکرومتری برای دستکاری و جداسازی اگزوزوم‌ها در حجم‌های کم نمونه استفاده می‌کنند. این روش‌ها می‌توانند بر اساس اصول مختلفی مانند فیلتراسیون بر اساس اندازه، جداسازی آکوستیک (acoustofluidics) ¹³، جداسازی الکتریکی (مانند دی‌الکتروفورز) یا به دام انداختن مبتنی بر میل ترکیبی در کانال‌های میکرو عمل کنند.⁷³
   • مزایا: نیاز به حجم نمونه بسیار کم، سرعت بالا، پتانسیل برای اتوماسیون، یکپارچه‌سازی با مراحل آنالیز و حساسیت بالا.
   • معایب: مقیاس‌پذیری برای پردازش حجم‌های بزرگ نمونه معمولاً محدود است، ممکن است نیاز به تجهیزات تخصصی داشته باشند، و استانداردسازی آن‌ها هنوز در حال انجام است.⁷³

هیچ یک از این روش‌های جداسازی به تنهایی کامل نیست و هر کدام دارای مجموعه‌ای از مزایا و معایب خاص خود از نظر پارامترهایی مانند خلوص نهایی، بازده (مقدار اگزوزوم بازیابی شده)، زمان مورد نیاز، هزینه، نیاز به تجهیزات خاص، حفظ یکپارچگی و عملکرد بیولوژیکی وزیکول‌ها، و قابلیت مقیاس‌پذیری برای کاربردهای مختلف هستند.⁴ انتخاب روش یا ترکیبی از روش‌های بهینه به شدت به منبع نمونه اولیه (مانند پلاسما، ادرار، محیط کشت)، حجم نمونه، هدف نهایی تحقیق یا کاربرد (مانند آنالیز پروتئومیکس که نیاز به خلوص بالا دارد، آزمایش عملکردی که نیاز به حفظ فعالیت بیولوژیکی دارد، یا تولید در مقیاس بزرگ برای استفاده درمانی) و منابع و تخصص موجود در آزمایشگاه بستگی دارد. در بسیاری از موارد، به ویژه زمانی که خلوص بالا مورد نیاز است، از ترکیبی از روش‌ها استفاده می‌شود. به عنوان مثال، یک پروتکل رایج ممکن است شامل سانتریفیوژ افتراقی اولیه برای حذف سلول‌ها و بقایا، و سپس اولتراسانتریفیوژ و به دنبال آن خالص‌سازی بیشتر با گرادیان چگالی یا SEC باشد.⁹

• B. تکنیک‌های کمی‌سازی و خصوصیات

پس از جداسازی، تأیید حضور اگزوزوم‌ها و خصوصیات آن‌ها از نظر تعداد، اندازه، مورفولوژی و ترکیب مولکولی ضروری است.

1. آنالیز ردیابی نانوذرات (NTA): همانطور که قبلاً ذکر شد، NTA اندازه هیدرودینامیکی و غلظت (تعداد ذرات در واحد حجم) را اندازه‌گیری می‌کند.³ این روش به طور گسترده برای کمی‌سازی اولیه استفاده می‌شود، اما باید به محدودیت‌های آن توجه داشت.⁸²
2. فلوسایتومتری (Flow Cytometry – FCM): فلوسایتومتری استاندارد معمولاً برای تجزیه و تحلیل ذرات بزرگتر مانند سلول‌ها طراحی شده است و حساسیت کافی برای تشخیص EV های منفرد، به ویژه اگزوزوم‌های کوچکتر را ندارد. با این حال، توسعه فلوسایتومترهای با وضوح بالا (high-resolution FCM) یا فلوسایتومترهای اختصاصی نانو (nanoFCM) امکان تجزیه و تحلیل تک‌وزیکولی EV ها را فراهم کرده است. این تکنیک‌ها می‌توانند اطلاعاتی در مورد اندازه نسبی (بر اساس پراکندگی نور) و بیان نشانگرهای سطحی (با استفاده از آنتی‌بادی‌های نشاندار شده با فلورسانس) ارائه دهند و امکان فنوتیپ‌بندی و کمی‌سازی زیرجمعیت‌های خاص EV را فراهم می‌کنند.¹ با این حال، استانداردسازی پروتکل‌ها و کالیبراسیون با مواد مرجع مناسب برای اطمینان از نتایج قابل اعتماد و قابل مقایسه همچنان یک چالش است.⁸²
3. سنجش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA): ELISA یک روش رایج و حساس برای تشخیص و کمی‌سازی پروتئین‌های خاص در یک نمونه است. می‌توان از ELISA برای اندازه‌گیری سطح پروتئین‌های نشانگر اگزوزوم (مانند CD63، CD81، CD9) در لیزات اگزوزوم استفاده کرد. همچنین می‌توان از فرمت‌های ELISA مبتنی بر جذب (capture ELISA) استفاده کرد که در آن اگزوزوم‌های دست نخورده ابتدا توسط یک آنتی‌بادی متصل به سطح چاهک (مانند آنتی-CD63) به دام افتاده و سپس با استفاده از آنتی‌بادی دیگری علیه یک نشانگر دیگر (مانند آنتی-CD81 نشاندار شده با آنزیم) شناسایی می‌شوند. این روش‌ها می‌توانند برای کمی‌سازی نسبی اگزوزوم‌های حامل نشانگرهای خاص مفید باشند.³
4. وسترن بلات (Western Blotting – WB): WB یک تکنیک استاندارد و ضروری برای تأیید کیفی حضور پروتئین‌های نشانگر اگزوزومی (هم نشانگرهای مثبت مانند تتراسپانین‌ها و Alix/TSG101 و هم نشانگرهای منفی مانند کالنکسین) در آماده‌سازی‌های اگزوزوم لیز شده است.¹ این روش به تأیید هویت وزیکول‌های جدا شده به عنوان اگزوزوم (یا حداقل غنی از اگزوزوم) و ارزیابی خلوص آن‌ها کمک می‌کند.
5. پراکندگی نور دینامیکی (DLS): DLS اندازه هیدرودینامیکی متوسط و شاخص پلی‌دیسپرسیتی (PDI) جمعیت EV را اندازه‌گیری می‌کند.³ این روش سریع و آسان است اما اطلاعات دقیقی در مورد توزیع اندازه یا غلظت ارائه نمی‌دهد و به شدت به ناهمگونی نمونه حساس است.
6. میکروسکوپی: TEM، SEM و AFM برای ارزیابی مورفولوژی و تأیید ساختار وزیکولی استفاده می‌شوند، همانطور که در بخش III.A توضیح داده شد.
7. آنالیز محموله:
   • طیف‌سنجی جرمی (Mass Spectrometry – MS): برای شناسایی و کمی‌سازی جامع پروتئین‌ها (پروتئومیکس) و لیپیدها (لیپیدومیکس) در اگزوزوم‌ها استفاده می‌شود.¹
   • توالی‌یابی RNA (RNA Sequencing) و PCR: برای تجزیه و تحلیل محتوای انواع مختلف RNA (مانند miRNA، mRNA، lncRNA) در اگزوزوم‌ها به کار می‌رود.²⁹ Real-time PCR می‌تواند برای کمی‌سازی RNA های خاص استفاده شود.⁹²

با توجه به ماهیت پیچیده و ناهمگون اگزوزوم‌ها و محدودیت‌های هر یک از تکنیک‌های آنالیز، انجام خصوصیات جامع نیازمند استفاده از ترکیبی از روش‌های مکمل است. تکیه بر تنها یک تکنیک (مانند فقط NTA یا فقط WB برای یک نشانگر) برای نتیجه‌گیری در مورد حضور یا کمیت اگزوزوم‌ها کافی نیست و می‌تواند منجر به تفسیرهای نادرست شود. دستورالعمل‌های MISEV توصیه می‌کنند که برای هر آماده‌سازی EV، اطلاعاتی در مورد حداقل سه دسته از ویژگی‌ها ارائه شود: 1) خصوصیات کلی جمعیت EV (مانند مقدار کل پروتئین یا تعداد ذرات)، 2) خصوصیات تک‌وزیکولی (مانند مورفولوژی با میکروسکوپی، اندازه با NTA/TEM/AFM) و 3) خصوصیات بیوشیمیایی (تأیید حضور حداقل سه نشانگر پروتئینی مثبت و عدم حضور نشانگرهای منفی با WB یا روش‌های مشابه، و در صورت لزوم، آنالیز محموله).¹⁰ این رویکرد چندوجهی برای اطمینان از کیفیت، تکرارپذیری و قابلیت مقایسه نتایج در تحقیقات اگزوزوم ضروری است.

VI. ویژگی‌های کلیدی اضافی اگزوزوم‌ها

علاوه بر مورفولوژی، اندازه و ترکیب مولکولی، چندین ویژگی دیگر نیز برای درک بیولوژی و پتانسیل کاربردی اگزوزوم‌ها اهمیت دارند.

• A. پایداری، نیمه عمر در گردش و مکانیسم‌های پاکسازی

پایداری اگزوزوم‌ها و محموله آن‌ها، هم در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) و هم در محیط بیولوژیکی (in vivo)، یک عامل حیاتی برای عملکرد و کاربرد آن‌ها است.

• پایداری محموله: یکی از مزایای کلیدی اگزوزوم‌ها این است که غشای لیپیدی آن‌ها از محموله داخلی، به ویژه مولکول‌های حساس مانند RNA، در برابر تخریب توسط آنزیم‌های موجود در محیط خارج سلولی (مانند RNase ها) محافظت می‌کند.¹¹ گزارش شده است که RNA استخراج شده از اگزوزوم‌ها می‌تواند برای مدت طولانی (حتی سال‌ها) در دمای 20- یا 80- درجه سانتی‌گراد پایدار بماند.³⁷ این پایداری برای حفظ عملکرد بیولوژیکی محموله منتقل شده و همچنین برای استفاده از اگزوزوم‌ها در بیوپسی مایع اهمیت دارد.
• پایداری ساختاری: پایداری فیزیکی خود وزیکول‌های اگزوزوم تحت شرایط مختلف نگهداری و پردازش می‌تواند متفاوت باشد. به عنوان مثال، انجماد و ذوب مکرر نمونه‌ها ممکن است به یکپارچگی غشاء آسیب رسانده و بر عملکرد یا محتوای RNA تأثیر بگذارد.⁸⁴ شرایط نگهداری بهینه (مانند دما، بافر) برای حفظ پایداری طولانی مدت اگزوزوم‌ها، به ویژه برای کاربردهای درمانی، هنوز به طور کامل مشخص نشده است و نیاز به تحقیقات بیشتری دارد.¹⁰⁸ لیوفیلیزاسیون (خشک کردن انجمادی) به عنوان یک استراتژی بالقوه برای افزایش پایداری در دمای اتاق یا 4 درجه سانتی‌گراد پیشنهاد شده است، اما تأثیر آن بر عملکرد اگزوزوم‌ها باید به دقت ارزیابی شود.¹⁰⁸
• نیمه عمر در گردش (Circulation Half-life): هنگامی که اگزوزوم‌ها (به ویژه اگزوزوم‌های اگزوژن که از خارج به بدن تزریق می‌شوند) به صورت سیستمیک (مثلاً داخل وریدی) تجویز می‌شوند، معمولاً نیمه عمر بسیار کوتاهی در جریان خون دارند. مطالعات فارماکوکینتیک نشان داده‌اند که غلظت اگزوزوم‌های در گردش به سرعت کاهش می‌یابد و نیمه عمر آن‌ها اغلب در محدوده چند دقیقه (معمولاً بین 2 تا 30 دقیقه) گزارش می‌شود.⁹³
• مکانیسم‌های پاکسازی (Clearance Mechanisms): دلیل اصلی این نیمه عمر کوتاه، پاکسازی سریع اگزوزوم‌ها از گردش خون توسط سیستم فاگوسیت تک‌هسته‌ای (Mononuclear Phagocyte System – MPS)، که قبلاً به عنوان سیستم رتیکولواندوتلیال (Reticuloendothelial System – RES) شناخته می‌شد، است. سلول‌های فاگوسیتیک، به ویژه ماکروفاژهای مقیم در اندام‌هایی مانند کبد (سلول‌های کوپفر) و طحال، به سرعت اگزوزوم‌های در گردش را شناسایی و جذب می‌کنند.⁹³ این پاکسازی سریع یک چالش بزرگ برای کاربردهای درمانی سیستمیک اگزوزوم‌ها محسوب می‌شود، زیرا مقدار اگزوزومی که به بافت یا سلول هدف مورد نظر می‌رسد را به شدت محدود می‌کند و در نتیجه فراهمی زیستی (bioavailability) و کارایی درمانی بالقوه آن‌ها را کاهش می‌دهد.

نیمه عمر کوتاه در گردش اگزوزوم‌های اگزوژن ⁹³ یکی از موانع اصلی بر سر راه توسعه کاربردهای درمانی سیستمیک آن‌ها است. برای غلبه بر این مشکل، استراتژی‌های مختلفی برای افزایش پایداری اگزوزوم‌ها در گردش خون و کاهش سرعت پاکسازی آن‌ها توسط MPS/RES در حال بررسی است. این استراتژی‌ها عمدتاً شامل مهندسی سطح اگزوزوم‌ها برای “پنهان کردن” آن‌ها از سیستم ایمنی است. به عنوان مثال، بیان پروتئین CD47 بر روی سطح اگزوزوم‌ها (که به عنوان سیگنال “مرا نخور” عمل می‌کند و تعامل با گیرنده SIRPα روی ماکروفاژها را مهار می‌کند) ³⁹ یا اتصال پلیمرهای آب‌دوست مانند پلی‌اتیلن گلیکول (PEG) به سطح اگزوزوم (پگیلاسیون) می‌تواند به افزایش زمان گردش و بهبود هدف‌گیری کمک کند.¹⁰⁸ توسعه چنین روش‌هایی برای افزایش فراهمی زیستی اگزوزوم‌ها در بافت‌های هدف برای تحقق پتانسیل درمانی آن‌ها حیاتی است.

• B. ناهمگونی در جمعیت اگزوزوم‌ها

یکی از چالش‌های مهم در تحقیقات اگزوزوم، ناهمگونی (Heterogeneity) ذاتی جمعیت آن‌ها است. حتی اگزوزوم‌هایی که از یک نوع سلول خاص در شرایط کشت کنترل شده ترشح می‌شوند، یک جمعیت همگن نیستند و از نظر ویژگی‌های مختلف با یکدیگر تفاوت دارند.¹

این ناهمگونی در جنبه‌های مختلفی مشاهده می‌شود:

• اندازه: همانطور که قبلاً بحث شد، اگزوزوم‌ها دارای توزیع اندازه هستند و قطر آن‌ها در یک محدوده مشخص متغیر است.⁶
• ترکیب مولکولی: محتوای پروتئینی، لیپیدی و اسید نوکلئیکی می‌تواند بین اگزوزوم‌های منفرد متفاوت باشد.⁶ ممکن است زیرجمعیت‌هایی از اگزوزوم‌ها وجود داشته باشند که در مولکول‌های خاصی غنی شده‌اند.
• نشانگرهای سطحی: بیان و فراوانی نشانگرهای سطحی مانند تتراسپانین‌ها می‌تواند در بین اگزوزوم‌ها متفاوت باشد.³⁰
• عملکرد بیولوژیکی: در نتیجه تفاوت در محتوا و نشانگرهای سطحی، زیرجمعیت‌های مختلف اگزوزوم ممکن است عملکردهای بیولوژیکی متفاوتی داشته باشند یا سلول‌های هدف متفاوتی را تحت تأثیر قرار دهند.⁶

عوامل متعددی به این ناهمگونی کمک می‌کنند:

• منشأ سلولی: اگزوزوم‌های مشتق از انواع مختلف سلول‌ها به طور طبیعی متفاوت هستند.⁴⁰
• وضعیت سلول: وضعیت فیزیولوژیکی یا پاتولوژیکی سلول والد (مانند استرس، فعال‌سازی، تمایز، بیماری) می‌تواند بر تعداد و ترکیب اگزوزوم‌های ترشح شده تأثیر بگذارد.⁶
• مسیرهای بیوژنز: وجود مسیرهای متعدد برای تشکیل ILV (وابسته و مستقل از ESCRT) می‌تواند منجر به تولید اگزوزوم‌هایی با ویژگی‌های متفاوت شود.⁷
• زیرجمعیت‌های MVB: ممکن است انواع مختلفی از MVB ها در یک سلول وجود داشته باشند که هر کدام ILV های متفاوتی را تولید می‌کنند یا سرنوشت متفاوتی (ترشح در مقابل تخریب) دارند.²⁰

ناهمگونی اگزوزوم‌ها هم یک چالش و هم یک فرصت محسوب می‌شود. از یک سو، این ناهمگونی، خصوصیات دقیق، استانداردسازی تولید و ارزیابی عملکرد اگزوزوم‌ها را برای کاربردهای تشخیصی و درمانی دشوار می‌سازد.³⁸ آماده‌سازی‌های “اگزوزوم” که با روش‌های رایج جداسازی به دست می‌آیند، در واقع مخلوطی از وزیکول‌های مختلف هستند و مشخص نیست که کدام زیرجمعیت مسئول اثر مشاهده شده است. از سوی دیگر، این ناهمگونی نشان می‌دهد که ممکن است زیرجمعیت‌های خاصی از اگزوزوم‌ها وجود داشته باشند که دارای عملکرد بیولوژیکی یا پتانسیل درمانی ویژه‌ای هستند (مثلاً غنی از یک miRNA درمانی خاص یا دارای توانایی هدف‌گیری بالا). بنابراین، توسعه روش‌های پیشرفته‌تر برای جداسازی، شناسایی و تجزیه و تحلیل زیرجمعیت‌های متمایز اگزوزومی (مانند استفاده از فلوسایتومتری چند رنگ با وضوح بالا، جداسازی مبتنی بر میل ترکیبی برای نشانگرهای خاص، یا تکنیک‌های آنالیز تک‌وزیکولی) برای درک عمیق‌تر بیولوژی اگزوزوم و بهره‌برداری هدفمندتر از پتانسیل آن‌ها در آینده بسیار مهم است.³²

• C. تعامل با سلول‌های گیرنده و مسیرهای جذب

برای اینکه اگزوزوم‌ها بتوانند عملکرد بیولوژیکی خود را اعمال کنند یا به عنوان حامل دارو عمل نمایند، باید با سلول‌های گیرنده هدف تعامل کرده و محموله خود را به آن‌ها تحویل دهند.

• هدف‌گیری (Targeting): یکی از جنبه‌های جذاب بیولوژی اگزوزوم، پتانسیل آن‌ها برای هدف‌گیری انتخابی سلول‌ها یا بافت‌های خاص است. مکانیسم‌های دقیق این هدف‌گیری هنوز به طور کامل شناخته نشده‌اند، اما احتمالاً شامل برهمکنش‌های خاص بین مولکول‌های موجود در سطح اگزوزوم (مانند پروتئین‌های غشایی خاص، اینتگرین‌ها یا حتی الگوهای گلیکوزیلاسیون) و گیرنده‌ها یا مولکول‌های مکمل در سطح سلول گیرنده است.²² برخی اگزوزوم‌ها ممکن است تمایل ذاتی برای تجمع در اندام‌های خاص (مانند کبد و طحال به دلیل پاکسازی توسط MPS) یا بافت‌های آسیب‌دیده یا ملتهب داشته باشند. علاوه بر این، محققان در حال توسعه استراتژی‌هایی برای مهندسی سطح اگزوزوم‌ها با پپتیدها، آپتامرها یا آنتی‌بادی‌های هدف‌گیرنده هستند تا میل ترکیبی آن‌ها را به سلول‌ها یا بافت‌های مورد نظر افزایش دهند و کارایی درمانی آن‌ها را بهبود بخشند.³⁸
• جذب (Uptake): پس از رسیدن به سلول هدف، اگزوزوم‌ها باید وارد آن شوند. همانطور که قبلاً ذکر شد، چندین مسیر برای جذب اگزوزوم توسط سلول‌های گیرنده وجود دارد، از جمله مسیرهای مختلف اندوسیتوزی (وابسته به کلاترین، وابسته به کاوئولین، ماکروپینوسیتوز، فاگوسیتوز) و همچنین همجوشی مستقیم با غشای پلاسمایی.¹¹ به نظر می‌رسد مسیر جذب غالب می‌تواند بسته به نوع سلول گیرنده، نوع اگزوزوم (منبع و ترکیب سطحی) و شرایط محیطی متفاوت باشد.
• سرنوشت درون سلولی (Intracellular Fate): پس از ورود به سلول از طریق اندوسیتوز، اگزوزوم‌ها معمولاً در اندوزوم‌های اولیه یا تأخیری قرار می‌گیرند. از آنجا، سرنوشت آن‌ها می‌تواند متفاوت باشد:
  • آزادسازی محموله: اگزوزوم‌ها ممکن است با غشای اندوزوم همجوشی پیدا کرده و محموله خود را به سیتوزول آزاد کنند، یا ممکن است از اندوزوم فرار کرده (endosomal escape) و مستقیماً وارد سیتوزول شوند. این مرحله برای عملکرد محموله‌هایی مانند RNA ها یا پروتئین‌های سیتوزولی ضروری است.¹⁹
  • تخریب لیزوزومی: اگزوزوم‌ها ممکن است به لیزوزوم‌ها هدایت شده و در آنجا همراه با محموله‌شان تخریب شوند.²²

درک دقیق مکانیسم‌های هدف‌گیری، جذب و سرنوشت درون سلولی اگزوزوم‌ها برای بهینه‌سازی کاربردهای درمانی آن‌ها، به ویژه در زمینه تحویل دارو، بسیار حیاتی است.²² برای اینکه یک داروی بسته‌بندی شده در اگزوزوم مؤثر باشد، باید اطمینان حاصل کرد که اگزوزوم به طور کارآمد توسط سلول‌های هدف صحیح جذب می‌شود، از تخریب پیش از موعد (مانند تخریب لیزوزومی) جلوگیری می‌شود و محموله درمانی به طور مؤثر در محل عملکرد خود (مثلاً سیتوپلاسم برای siRNA یا هسته برای ابزارهای ویرایش ژن) آزاد می‌شود. مهندسی اگزوزوم‌ها برای بهبود این مراحل، یک حوزه تحقیقاتی فعال است.

• D. غلظت در مایعات بیولوژیکی

همانطور که پیشتر اشاره شد، اگزوزوم‌ها به طور طبیعی در غلظت‌های بالایی در اکثر مایعات بیولوژیکی بدن یافت می‌شوند.³ غلظت دقیق می‌تواند بسته به نوع مایع (مثلاً پلاسما معمولاً غنی‌تر از ادرار است)، وضعیت فیزیولوژیکی فرد (مانند سن، جنس، بارداری) و وجود بیماری متفاوت باشد. به طور خاص، گزارش شده است که غلظت اگزوزوم‌های در گردش خون در بیماران مبتلا به انواع مختلف سرطان به طور قابل توجهی بالاتر از افراد سالم است.³⁷

غلظت اگزوزوم‌ها معمولاً با استفاده از تکنیک NTA اندازه‌گیری می‌شود و بر حسب تعداد ذره در هر میلی‌لیتر (particles/mL) بیان می‌شود.⁴ مقادیر گزارش شده بسیار متغیر هستند اما اغلب در محدوده 10^9 تا 10^12 ذره/میلی‌لیتر یا حتی بیشتر در پلاسما یا سرم قرار دارند.⁴⁰

غلظت بالای اگزوزوم‌ها در مایعات بدن که به راحتی قابل نمونه‌برداری هستند (مانند خون، ادرار، بزاق)، همراه با پایداری نسبی محموله آن‌ها، آن‌ها را به نامزدهای بسیار جذابی برای توسعه روش‌های “بیوپسی مایع” (Liquid Biopsy) تبدیل کرده است.² ایده اصلی این است که با تجزیه و تحلیل اگزوزوم‌ها و محموله مولکولی آن‌ها در یک نمونه مایع، بتوان اطلاعاتی در مورد وجود، نوع، مرحله یا پاسخ به درمان یک بیماری (به ویژه سرطان) در یک اندام دوردست به دست آورد، بدون نیاز به نمونه‌برداری تهاجمی از خود بافت. تغییرات در غلظت کل اگزوزوم‌ها یا فراوانی زیرجمعیت‌های خاص (مانند آن‌هایی که نشانگرهای توموری را بیان می‌کنند) یا شناسایی مولکول‌های خاص بیماری (مانند جهش‌های DNA یا RNA های انکوژنیک) در داخل اگزوزوم‌ها، همگی پتانسیل استفاده به عنوان نشانگرهای زیستی تشخیصی، پیش‌آگهی یا نظارتی را دارند.³⁷

• E. خواص مکانیکی

مطالعات اخیر با استفاده از AFM شروع به بررسی خواص مکانیکی اگزوزوم‌ها کرده‌اند. این مطالعات نشان داده‌اند که اگزوزوم‌ها دارای ویژگی‌های الاستیک هستند، به این معنی که می‌توانند تحت فشار خارجی (مانند فشار نوک AFM) تغییر شکل دهند و پس از برداشتن فشار، تا حدی به شکل اولیه خود بازگردند (تغییر شکل برگشت‌پذیر).⁹⁴ با این حال، اعمال نیروهای بیش از حد می‌تواند منجر به پارگی غشای اگزوزوم شود.⁹⁴

این خواص مکانیکی احتمالاً تحت تأثیر ترکیب لیپیدی و پروتئینی غشای اگزوزوم قرار دارند. همانطور که در Insight 6 اشاره شد، این ویژگی‌ها ممکن است پیامدهای عملکردی داشته باشند و بر نحوه تعامل اگزوزوم‌ها با سلول‌ها، پایداری آن‌ها در محیط‌های بیولوژیکی و کارایی آن‌ها به عنوان حامل‌های دارو تأثیر بگذارند.⁹⁴ به عنوان مثال، انعطاف‌پذیری غشاء ممکن است همجوشی با سلول گیرنده یا فرار از اندوزوم را تسهیل کند، در حالی که سختی بیشتر ممکن است پایداری در گردش خون را افزایش دهد. درک بهتر رابطه بین ترکیب، ساختار و خواص مکانیکی اگزوزوم‌ها می‌تواند به طراحی منطقی اگزوزوم‌های مهندسی شده با ویژگی‌های فیزیکی بهینه برای کاربردهای خاص کمک کند.

جدول 2: خلاصه ویژگی‌های کلیدی اگزوزوم‌ها

VII. کاربردهای درمانی اگزوزوم‌ها

پتانسیل اگزوزوم‌ها برای استفاده در کاربردهای بالینی، هم به عنوان ابزارهای تشخیصی و هم به عنوان عوامل درمانی، یکی از محرک‌های اصلی تحقیقات گسترده در این زمینه است.

• A. پتانسیل به عنوان نشانگرهای زیستی تشخیصی و پیش‌آگهی

همانطور که پیشتر ذکر شد، اگزوزوم‌ها در مایعات مختلف بدن به وفور یافت می‌شوند و محموله مولکولی آن‌ها (پروتئین‌ها، RNA ها، لیپیدها و حتی DNA) منعکس‌کننده وضعیت فیزیولوژیکی یا پاتولوژیکی سلول‌های والد آن‌ها است.⁵ این ویژگی، اگزوزوم‌ها را به منبعی غنی از نشانگرهای زیستی بالقوه برای تشخیص، پیش‌آگهی و نظارت بر طیف وسیعی از بیماری‌ها، به ویژه سرطان، تبدیل می‌کند.²

استفاده از اگزوزوم‌ها در قالب “بیوپسی مایع” چندین مزیت بالقوه نسبت به بیوپسی بافتی سنتی دارد:

• غیرتهاجمی یا کم‌تهاجمی: نمونه‌برداری از مایعات بدن مانند خون، ادرار یا بزاق بسیار آسان‌تر و کم‌خطرتر از نمونه‌برداری از بافت است.²
• نظارت مکرر: امکان نمونه‌برداری مکرر در طول زمان برای نظارت بر پیشرفت بیماری یا پاسخ به درمان را فراهم می‌کند.²
• پایداری محموله: محموله مولکولی، به ویژه اسیدهای نوکلئیک، در داخل اگزوزوم‌ها در برابر تخریب محافظت می‌شود و امکان تشخیص آن‌ها را حتی در غلظت‌های پایین فراهم می‌کند.¹¹
• منبع اطلاعاتی غنی: اگزوزوم‌ها می‌توانند اطلاعاتی را از سلول‌های توموری اولیه و همچنین متاستازها یا سلول‌های TME حمل کنند و دید جامعی از وضعیت بیماری ارائه دهند.

تحقیقات زیادی بر روی شناسایی نشانگرهای زیستی اگزوزومی برای بیماری‌های مختلف در حال انجام است. به عنوان مثال، افزایش سطح کلی اگزوزوم‌ها یا وجود پروتئین‌های خاص تومور مانند PSA (آنتی‌ژن اختصاصی پروستات) یا CEA (آنتی‌ژن کارسینوامبریونیک) در اگزوزوم‌های بیماران سرطانی گزارش شده است.⁹⁵ همچنین، شناسایی جهش‌های DNA توموری یا بیان غیرطبیعی miRNA ها و سایر RNA ها در اگزوزوم‌های در گردش به عنوان نشانگرهای بالقوه مورد بررسی قرار گرفته است. در بیماری‌های نورودژنراتیو، تشخیص پروتئین‌های پاتولوژیک (مانند آمیلوئید بتا یا تاو) یا نشانگرهای التهاب عصبی در اگزوزوم‌های CSF یا خون ممکن است به تشخیص زودهنگام کمک کند.² در بیماری‌های قلبی-عروقی نیز تغییرات در محتوای miRNA یا پروتئین اگزوزوم‌ها با وضعیت‌های مختلف مانند سکته قلبی یا نارسایی قلبی مرتبط دانسته شده است.⁶⁶

با وجود پتانسیل بالا، چالش‌های مهمی برای ترجمه بالینی نشانگرهای زیستی اگزوزومی وجود دارد. مهم‌ترین چالش‌ها شامل نیاز به توسعه و استانداردسازی روش‌های جداسازی و آنالیز اگزوزوم است که حساسیت، اختصاصیت و تکرارپذیری بالایی داشته باشند.¹ ناهمگونی اگزوزوم‌ها و همپوشانی با سایر EV ها نیز می‌تواند آنالیز را پیچیده کند. علاوه بر این، نشانگرهای شناسایی شده باید در مطالعات بالینی بزرگ و معتبر تأیید شوند تا ارزش تشخیصی یا پیش‌آگهی آن‌ها اثبات گردد.

• B. اگزوزوم‌ها به عنوان عوامل درمانی و حامل‌های تحویل دارو

علاوه بر کاربردهای تشخیصی، اگزوزوم‌ها به دلیل ویژگی‌های بیولوژیکی منحصر به فرد خود، به عنوان عوامل درمانی مستقیم یا به عنوان سیستم‌های تحویل دارو مورد توجه قرار گرفته‌اند.

1. درمان بدون سلول (Cell-free Therapy): این رویکرد از خواص درمانی ذاتی خود اگزوزوم‌ها، بدون نیاز به تجویز سلول‌های زنده، بهره می‌برد. تمرکز اصلی در این زمینه بر روی اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های بنیادی، به ویژه MSC ها، بوده است.⁶ اعتقاد بر این است که بسیاری از اثرات درمانی مشاهده شده با MSC ها، در واقع از طریق اگزوزوم‌های ترشح شده توسط آن‌ها اعمال می‌شود. این اگزوزوم‌ها حاوی مجموعه‌ای از فاکتورهای رشد، سیتوکین‌های ضدالتهابی، miRNA های تنظیم‌کننده و سایر مولکول‌هایی هستند که می‌توانند فرآیندهای ترمیم بافت (مانند بهبود زخم، بازسازی غضروف و استخوان)، کاهش التهاب، تعدیل پاسخ ایمنی و محافظت سلولی را القا کنند. استفاده از اگزوزوم‌ها به جای سلول‌های کامل، مزایایی مانند کاهش خطر رد ایمنی، عدم نگرانی در مورد تشکیل تومور (tumorigenicity) و سهولت بیشتر در تولید، نگهداری و تجویز را به همراه دارد.⁵⁰ مطالعات پیش‌بالینی متعددی اثربخشی اگزوزوم‌های MSC را در مدل‌های حیوانی بیماری‌های مختلف نشان داده‌اند و چندین کارآزمایی بالینی اولیه نیز در حال انجام یا تکمیل شده است.⁴⁵
2. تحویل دارو (Drug Delivery): اگزوزوم‌ها به عنوان حامل‌های طبیعی نانومتری، پتانسیل بالایی برای استفاده به عنوان سیستم‌های تحویل هدفمند دارو دارند.³⁵ محققان می‌توانند اگزوزوم‌ها را برای حمل و تحویل انواع مختلفی از محموله‌های درمانی مهندسی کنند، از جمله:
   • داروهای شیمی‌درمانی کوچک مولکول: مانند دوکسوروبیسین یا پاکلیتاکسل، برای هدف قرار دادن سلول‌های سرطانی و کاهش سمیت سیستمیک.³⁸
   • اسیدهای نوکلئیک درمانی: مانند siRNA یا shRNA برای خاموش کردن بیان ژن‌های بیماری‌زا، miRNA های درمانی (یا آنتی-miRNA ها) برای تنظیم مسیرهای سلولی، یا حتی پلاسمیدهای DNA یا سیستم‌های ویرایش ژن مانند CRISPR-Cas9 برای ژن‌درمانی.³⁵
   • پروتئین‌ها یا پپتیدهای درمانی: مانند آنزیم‌ها، آنتی‌بادی‌ها یا پپتیدهای سیگنال‌دهنده.⁵⁸
   مزایای استفاده از اگزوزوم‌ها به عنوان حامل دارو عبارتند از:
   • زیست‌سازگاری و ایمنی‌زایی پایین: به دلیل منشأ بیولوژیکی و شباهت به اجزای بدن، انتظار می‌رود اگزوزوم‌ها پاسخ ایمنی کمتری نسبت به نانوحامل‌های مصنوعی ایجاد کنند.¹¹
   • توانایی عبور از موانع بیولوژیکی: اندازه کوچک و ترکیب غشایی خاص اگزوزوم‌ها ممکن است به آن‌ها اجازه دهد از موانعی مانند سد خونی-مغزی عبور کرده و داروها را به سیستم عصبی مرکزی برسانند.²
   • هدف‌گیری: اگزوزوم‌ها ممکن است دارای توانایی هدف‌گیری ذاتی به سلول‌ها یا بافت‌های خاص باشند (homing)، و همچنین می‌توان سطح آن‌ها را برای افزایش هدف‌گیری فعال به گیرنده‌های خاص مهندسی کرد.³⁸
   • محافظت از محموله: غشای اگزوزوم از محموله درمانی در برابر تخریب در محیط بیولوژیکی محافظت می‌کند و به آزادسازی کنترل‌شده‌تر آن کمک می‌کند.¹¹
   روش‌های مختلفی برای بارگیری محموله درمانی به داخل اگزوزوم‌ها وجود دارد. این روش‌ها را می‌توان به دو دسته کلی تقسیم کرد:
   • بارگیری پیش از ترشح (Pre-loading): در این روش، سلول‌های والد به گونه‌ای مهندسی ژنتیکی می‌شوند که محموله درمانی مورد نظر (مثلاً یک پروتئین یا RNA خاص) را بیش از حد بیان کنند و آن را به طور طبیعی در اگزوزوم‌های ترشحی خود بسته‌بندی نمایند.³⁸
   • بارگیری پس از جداسازی (Post-loading): در این روش، اگزوزوم‌ها ابتدا از سلول‌های والد جداسازی و خالص‌سازی می‌شوند و سپس محموله درمانی با استفاده از روش‌های فیزیکی یا شیمیایی به داخل آن‌ها وارد می‌شود. این روش‌ها شامل انکوباسیون ساده دارو با اگزوزوم‌ها، استفاده از امواج فراصوت (سونیکاسیون)، اعمال پالس‌های الکتریکی (الکتروپوراسیون)، اکستروژن (عبور دادن مخلوط دارو و اگزوزوم از فیلترهای با منافذ کوچک)، یا استفاده از معرف‌های شیمیایی برای افزایش نفوذپذیری غشاء است.³⁸ هر یک از این روش‌ها مزایا و معایب خاص خود را از نظر کارایی بارگیری، تأثیر بر یکپارچگی اگزوزوم و نوع محموله قابل استفاده دارند.
3. واکسن‌های سرطانی (Cancer Vaccines): اگزوزوم‌ها، به ویژه آن‌هایی که از سلول‌های دندریتیک (DCs) که قوی‌ترین سلول‌های ارائه‌دهنده آنتی‌ژن هستند، مشتق می‌شوند (Dex)، به عنوان پلتفرم‌های بالقوه برای واکسیناسیون ضد سرطان مورد توجه قرار گرفته‌اند.⁴⁵ Dex ها می‌توانند آنتی‌ژن‌های مرتبط با تومور (Tumor-Associated Antigens – TAAs) را به همراه مولکول‌های MHC و مولکول‌های کمک‌تحریکی در سطح خود ارائه دهند و پاسخ‌های ایمنی سلول T (هم CD4+ و هم CD8+) را علیه سلول‌های سرطانی تحریک کنند. همچنین، اگزوزوم‌های مشتق از خود سلول‌های توموری که با آنتی‌ژن‌های توموری بارگیری شده‌اند نیز ممکن است برای تحریک ایمنی استفاده شوند. یکی از مزایای بالقوه واکسن‌های مبتنی بر Dex نسبت به واکسن‌های مبتنی بر سلول DC کامل، پایداری بیشتر آن‌ها و مقاومت بالقوه بالاتر در برابر مکانیسم‌های سرکوب ایمنی موجود در ریزمحیط تومور است.⁵² چندین کارآزمایی بالینی فاز I و II با استفاده از Dex در بیماران مبتلا به سرطان‌های پیشرفته انجام شده است که ایمنی و امکان‌پذیری این رویکرد و همچنین توانایی القای پاسخ‌های ایمنی سلولی (T و NK) را نشان داده‌اند، اگرچه اثربخشی بالینی قابل توجه هنوز محدود بوده است.⁵²

VIII. اگزوزوم‌های مناسب برای تزریق یا استفاده درمانی

انتخاب و آماده‌سازی اگزوزوم‌ها برای کاربردهای درمانی، به ویژه برای تزریق به بیماران، نیازمند ملاحظات دقیق و معیارهای کنترل کیفی سخت‌گیرانه‌ای است تا ایمنی و اثربخشی آن‌ها تضمین شود.

• A. معیارهای انتخاب اگزوزوم‌های درمانی در مقالات علمی

بر اساس مرور مقالات علمی و مرورهای تخصصی، معیارهای کلیدی زیر برای تعیین مناسب بودن اگزوزوم‌ها جهت استفاده درمانی مطرح شده‌اند:

1. منبع سلولی (Cell Source): انتخاب نوع سلول والد برای تولید اگزوزوم بسیار حیاتی است، زیرا منبع سلولی، محتوای ذاتی و خواص بیولوژیکی اگزوزوم را تعیین می‌کند.⁴⁰
   • سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs): به دلیل خواص بازسازی‌کننده، ضدالتهابی و تعدیل‌کننده ایمنی، MSC ها (از منابع مختلف مانند مغز استخوان، چربی، بند ناف) یکی از پرکاربردترین منابع برای تولید اگزوزوم‌های درمانی، به ویژه برای بیماری‌های دژنراتیو، التهابی و آسیب‌های بافتی هستند.⁴⁵
   • سلول‌های دندریتیک (DCs): برای کاربردهای ایمونوتراپی، به ویژه واکسن‌های سرطانی، به دلیل توانایی ارائه آنتی‌ژن و تحریک پاسخ‌های ایمنی، اگزوزوم‌های مشتق از DC (Dex) مورد توجه هستند.⁴⁵
   • سایر منابع: بسته به کاربرد، ممکن است از منابع دیگری مانند سلول‌های NK (برای ایمونوتراپی) ³⁹، سلول‌های اپیتلیال یا اندوتلیال، یا حتی سلول‌های گیاهی ⁶⁴ استفاده شود. استفاده از سلول‌های اتولوگ (از خود بیمار) یا آلوژنیک (از اهداکننده سالم) ملاحظات خاص خود را دارد.
2. محتوای درمانی (Therapeutic Cargo): اگزوزوم‌ها باید حاوی مولکول‌های زیست‌فعال مناسب برای اثر درمانی مورد نظر باشند. این می‌تواند محتوای ذاتی اگزوزوم (مانند فاکتورهای رشد یا miRNA های ضدالتهابی در اگزوزوم‌های MSC) یا محموله بارگیری شده به صورت خارجی (مانند siRNA یا دارو) باشد.³⁸ خصوصیات دقیق محموله کلیدی است.
3. خلوص و خصوصیات (Purity and Characterization): آماده‌سازی اگزوزوم باید تا حد امکان خالص باشد و عاری از آلاینده‌هایی مانند پروتئین‌های آزاد، سایر انواع EV ها، بقایای سلولی یا اجزای محیط کشت (مانند اندوتوکسین) باشد. خصوصیات جامع با استفاده از روش‌های استاندارد (TEM، NTA، WB برای نشانگرهای مثبت و منفی) برای تأیید هویت، اندازه، غلظت و خلوص ضروری است.¹
4. ایمنی (Safety): اگزوزوم‌های درمانی باید ایمن باشند و عوارض جانبی نامطلوب ایجاد نکنند. این شامل ارزیابی ایمنی‌زایی (Immunogenicity)، سمیت سلولی (Cytotoxicity)، پتانسیل ایجاد تومور (Tumorigenicity) (به ویژه اگر از سلول‌های بنیادی یا توموری مشتق شده باشند) و پاسخ‌های التهابی ناخواسته است.⁵⁰
5. کارایی (Efficacy): اگزوزوم‌ها باید قادر به رسیدن به بافت یا سلول هدف و اعمال اثر درمانی مورد نظر در مدل‌های پیش‌بالینی معتبر و در نهایت در کارآزمایی‌های بالینی باشند.⁴³ این شامل توانایی هدف‌گیری، جذب سلولی و آزادسازی مؤثر محموله است.
6. مقیاس‌پذیری و تولید مطابق با GMP: برای کاربرد بالینی، باید بتوان اگزوزوم‌ها را در مقادیر کافی، با کیفیت ثابت و مطابق با اصول تولید خوب (Good Manufacturing Practice – GMP) تولید کرد.⁴⁵ این شامل استانداردسازی کشت سلول والد، جداسازی اگزوزوم، فرمولاسیون و کنترل کیفی است.
7. پایداری: اگزوزوم‌ها باید در طول فرآیند تولید، نگهداری و تجویز، پایداری ساختاری و عملکردی خود را حفظ کنند.⁵⁹

• B. جدول اطلاعات فنی اگزوزوم‌های با پتانسیل درمانی

جدول زیر خلاصه‌ای از اطلاعات فنی مربوط به انواع اگزوزوم‌هایی که در مقالات علمی برای کاربردهای درمانی بالقوه (مانند تزریق یا تحویل دارو) مورد مطالعه قرار گرفته‌اند را ارائه می‌دهد. این اطلاعات بر اساس منابع ارائه شده گردآوری شده است و نمونه‌ای از تحقیقات در حال انجام را نشان می‌دهد.

جدول 3: اطلاعات فنی اگزوزوم‌های با پتانسیل درمانی

توجه: این جدول نمونه‌ای از کاربردهای گزارش شده است و جامع نیست. محتوای کلیدی، روش تجویز و یافته‌ها می‌تواند بسته به مطالعه خاص بسیار متفاوت باشد.

IX. ایمنی و ایمنی‌زایی اگزوزوم درمانی

یکی از ملاحظات حیاتی برای ترجمه بالینی درمان‌های مبتنی بر اگزوزوم، ارزیابی ایمنی و پتانسیل ایمنی‌زایی آن‌ها است.

• مزایای ایمنی بالقوه:
  • ایمنی‌زایی پایین: به طور کلی، اگزوزوم‌ها، به ویژه اگر از منابع اتولوگ (از خود بیمار) یا از سلول‌هایی با ایمنی‌زایی پایین مانند MSC ها مشتق شده باشند، نسبت به نانوذرات مصنوعی یا سلول‌های کامل، ایمنی‌زایی کمتری دارند.¹¹ ساختار طبیعی و ترکیب لیپیدی و پروتئینی مشابه بدن، احتمالاً به تحمل‌پذیری بهتر آن‌ها کمک می‌کند.
  • عدم تکثیر: برخلاف درمان‌های مبتنی بر سلول، اگزوزوم‌ها قادر به تکثیر نیستند، که خطر تشکیل تومور یا رشد کنترل نشده را از بین می‌برد.⁵⁴
  • زیست‌سازگاری و زیست‌تخریب‌پذیری: اگزوزوم‌ها به طور طبیعی در بدن وجود دارند و توسط مسیرهای فیزیولوژیکی پاکسازی و تخریب می‌شوند.⁵⁹
• ملاحظات و چالش‌های ایمنی:
  • منبع سلولی: ایمنی اگزوزوم‌ها به شدت به منبع سلولی آن‌ها وابسته است. اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های سرطانی ممکن است خود دارای خواص پیشبرنده تومور باشند و استفاده از آن‌ها به عنوان حامل دارو نیازمند مهندسی دقیق و ارزیابی کامل ایمنی است.⁶⁷ استفاده از سلول‌های آلوژنیک (از اهداکننده) ممکن است همچنان خطر پاسخ ایمنی را به همراه داشته باشد، اگرچه به نظر می‌رسد کمتر از سلول‌های کامل باشد.
  • آلاینده‌ها: فرآیند جداسازی و خالص‌سازی باید به گونه‌ای باشد که آلاینده‌های بالقوه مانند اندوتوکسین‌ها (از باکتری‌ها)، پروتئین‌های محیط کشت یا سایر اجزای سلولی که می‌توانند باعث پاسخ التهابی یا ایمنی شوند، حذف گردند.⁶⁵
  • دوز و روش تجویز: تعیین دوز ایمن و مؤثر و روش تجویز مناسب (موضعی در مقابل سیستمیک) برای هر کاربرد خاص ضروری است.⁷¹ تجویز سیستمیک با چالش پاکسازی سریع توسط سیستم ایمنی مواجه است.¹⁰⁹
  • توزیع زیستی و سمیت خارج از هدف: درک توزیع اگزوزوم‌ها در بدن پس از تجویز و اطمینان از اینکه آن‌ها به طور ناخواسته در بافت‌های سالم تجمع نیافته و سمیت ایجاد نمی‌کنند، مهم است.⁵⁷

کارآزمایی‌های بالینی اولیه که از اگزوزوم‌ها (عمدتاً مشتق از MSC یا DC) استفاده کرده‌اند، به طور کلی پروفایل ایمنی قابل قبولی را با عوارض جانبی خفیف تا متوسط گزارش کرده‌اند.⁴⁵ با این حال، تعداد این مطالعات هنوز محدود است و نیاز به کارآزمایی‌های بزرگتر با دوره‌های پیگیری طولانی‌تر برای ارزیابی کامل ایمنی و اثربخشی بلندمدت وجود دارد.⁴² توسعه دستورالعمل‌های نظارتی مشخص و روش‌های تولید استاندارد (GMP) برای تضمین ایمنی و کیفیت محصولات اگزوزومی برای استفاده بالینی ضروری است.⁴⁵

بررسی کیت های درجه یک دنیا

بر اساس معیارهای فنی، بیولوژیک، عملیاتی و اقتصادی، هفت پلتفرم را با یکدیگر مقایسه و ارزیابی می‌کنیم. هدف این است که خواننده – اعم از پژوهشگر یا پزشک – بتواند با آگاهی کامل از نقاط قوت و محدودیت‌های هر روش، کیت مناسب برای نیازهای بالینی یا تحقیقاتی خود را انتخاب کند.

جدول مقایسه‌ی هفت پلتفرم

ویژگی‌های «Exo‑PRP Arjang Bioinnovations»

• منبع: خون اتولوگ بیمار (8–10 mL) با لوله ACD-A
• فرآیند آماده‌سازی:
  1. دور اول سانتریفیوژ: 1,600 rpm × 10 min → جداسازی PRP از خون
  2. دور دوم سانتریفیوژ: پس از انتقال PRP به لوله تغلیظ (زرد)، 3,200 rpm × 5 min → تمرکز پلاکت
  3. رام‌سازی: رست 15 min + ورتکس → یکنواخت‌سازی مخلوط پلاکت‌-پلاسما
  4. فعال‌سازی: افزودن 2–3 mL اکتیواتور اگزوزوم + ورتکس 3 min
  5. سانتریفیوژ نهایی: 4,000 rpm × 15 min → برداشت 3–4 mL محصول نهایی
• مشخصات فنی:
  • میانگین اندازه: پیک 87.8 nm (بیش از 92.7 % ذرات < 100 nm)
  • غلظت ذرات: ≈ 5×10⁹ ذره/mL
  • پلی‌دیسپرسیتی (PDI): 0.162
  • نشانه‌های بیولوژیک: افزایش دو‌برابری سطح PDGF, VEGF, EGF پس از فعال‌سازی
• مزایای کلینیکی:
  • محصول یکپارچه و بدون افزودنی شیمیایی
  • آماده‌سازی با تجهیزات رایج آزمایشگاهی
  • زمان کل ≈ 1 ساعت از نمونه‌گیری تا تزریق
  • قابل استفاده در تزریقات مفصلی، پوستی و زیبایی

مقایسه و تحلیل دقیق

بر اساس جدول فوق، هفت پلتفرم در پنج محور اصلی قابل ارزیابی هستند:

1. روش جداسازی و کیفیت نانوساختار

• MCT Plasma: با تلفیق Photo‑Thermal و سردسازی، علاوه بر افزایش راندمان فتوشیمیایی، باعث تحریک متابولیسم و افزایش ATP می‌شود. خلوص بالا و یکنواختی قطر (PDI) کم از نقاط قوت است، اما نیاز به دستگاه اختصاصی MCT Unit® دارد.
• ExoQuick‑TC و Total Exo Isolation: روش‌های ارزان و سریع مبتنی بر رسوب PEG، اما از آلودگی مولکولی (PEG) رنج می‌برند و برای کاربردهای مولکولی حساس ایده‌آل نیستند.
• PureExo و exoEasy: ستون‌های جداسازی مبتنی بر فیلتراسیون/ستون سیلیکا، خلوص بسیار بالا و حفظ ساختار اگزوزوم اما هزینه‌بر و نیازمند تجهیزات خاص.
• ExoSpin: ترکیبی از کروماوگرافی سایز و سانتریفیوژ، خلوص و کارایی عملیاتی را متعادل می‌کند.
• Exo‑PRP Arzhang: دو مرحله سانتریفیوژ معقول، فعال‌سازی با ورتکس و اکتیواتور، پلاسما تقریباً عاری از افزودنی و قابل اعتماد با تجهیزات معمول.

نکته کلیدی: اگر اولویت شما «بدون آلودگی شیمیایی» و «سادگی عملیاتی» است، Exo‑PRP Arjang بهترین انتخاب بوده و پس از آن MCT Plasma با خلوص بسیار بالا، اگر دستگاه اختصاصی در دسترس دارید.

2. راندمان و مشخصات فیزیکی ذرات

• غلظت ذرات: MCT Plasma (1×10¹⁰) بالاترین راندمان را دارد، اما ExoSpin و Arzhang نیز در محدوده مطلوب (> 5×10⁹) قرار دارند.
• میانگین اندازه & PDI: Arzhang (87.8 nm, PDI 0.162) و MCT (62.6 nm, 0.198) نمایشگر نانومقیاس یکنواخت هستند؛ در حالی که ExoQuick‑TC با قطر بالاتر (~133 nm) و PDI ~ 0.3، پخش‌پذیری بزرگ‌تری دارد.
• درصد ذرات < 100 nm: Arzhang (92.7 %) و PureExo/​exoEasy (> 95 %) بالاترین خلوص قطر برتر را ارائه می‌کنند.

نکته کلیدی: برای کاربردهای نیازمند نفوذبخشی بالا (مثلاً تزریق داخل‌پوستی یا مفصلی)، اگزوزوم‌های زیر 100 nm (Arzhang، PureExo) مناسب‌ترند.

3. کارایی بیولوژیک و راندمان رشدعاملی

• MCT Plasma: افزایش دو برابر ATP و فاکتورهای رشد به‌واسطه Photo‑Thermal boosting و سردسازی—افکت بی‌نظیر در ترمیم بافت.
• Exo‑PRP Arzhang: نشان‌ داده افزایش دو برابر PDGF, VEGF, EGF را دارد (تصاویر میکروسکوپی اتولوگ)؛ با این حال مقایسه مستند MCT vs Arzhang نیازمند کارآزمایی مستقیم بالینی است.
• PureExo & exoEasy: روی RNA و پروتئین هدفمند بالینی متمرکزند، اما خود اگزوزوم فاقد فاکتور رشد درون‌پلاکتیک است.
• ExoQuick‑TC: کمترین اثرگذاری بیولوژیک مستقیم بر بازسازی بافت؛ بیشتر کاربردش در مطالعه پایه و غربالگری مولکولی است.

نکته کلیدی: اگر اولویت «اثر ترمیمی سریع» است، MCT Plasma و Exo‑PRP Arzhang به‌صورت تقریباً برابر پیشتازند.

4. سهولت کاربری، زمان و هزینه

• ExoQuick‑TC: کم‌هزینه ولی زمانبر (≈ 24 h)
• PureExo & exoEasy: متوسط هزینه، متوسط زمان (≈ 2–4 h) و نیاز به کیت‌های تخصصی
• MCT Plasma: نیاز MCT Unit®, زمان ≈ 1.5 h، هزینه بالا
• Exo‑PRP Arzhang: با سانتریفیوژ معمول + لوله ACD-A، زمان ≈ 1 h، هزینه پایین–متوسط

نکته کلیدی: از منظر «دسترسی تجهیزات»، Arzhang و ExoQuick ساده‌ترین هستند؛ از نظر زمان، Arzhang و MCT سریع‌ترینند.

5. مقیاس‌پذیری و تطبیق با سناریوهای بالینی

• پلتفرم‌های تشخیصی/پژوهشی (PureExo, exoEasy): برای تعداد کم نمونه با خلوص بالا مناسب
• پلتفرم‌های پایه (ExoQuick, Total Exo): برای پردازش انبوه و تحقیقات بزرگ‌مقیاس
• پلتفرم‌های درمانی (MCT, Arjang): برای حجم کم تا متوسط (2–10 mL) با تمرکز بر کاربرد داخل‌تنی
• ExoSpin: تعادل مناسب برای پژوهش و درمان

نکته کلیدی: اگر مرکز شما «تزریقات اتولوگ چند بیمار در روز» دارد، Arzhang و MCT می‌توانند پاسخگو باشند. اگر مایلید نمونه‌های متعدد مولکولی را غربال کنید، ExoQuick و Total Exo مناسبند.

نتیجه‌گیری کلی

۱. Exo‑PRP Arjang (اتولوگ نوآوران سلامت ارژنگ):

• مناسب برای مراکز با دسترسی به سانتریفیوژ معمولی و کیفیت قابل قبول بیولوژیک
• بدون آلودگی شیمیایی، آماده‌سازی سریع (≈ 1 h)، هزینه کم
• مناسب برای تزریق‌های داخل‌مفصلی، ترمیم پوستی و زیبایی

2. MCT Plasma (MetacellTech):
   • بهترین اثر ترمیمی و بیولوژیک (↑ATP، ↑GF)، خلوص بالا
   • نیاز به دستگاه اختصاصی، هزینه و زمان متوسط
3. PureExo Kit / exoEasy:
   • برای مطالعات مولکولی و تشخیصی با خلوص فوق‌العاده و حفظ ساختار RNA/protein
4. ExoQuick‑TC / Total Exo Isolation:
   • گزینه‌های اقتصادی و مقیاس‌پذیر برای پژوهش پایه و غربال‌گری انبوه
5. ExoSpin:
   • تعادلی از خلوص بالا و راندمان حفظ عملکرد زیستی

با در نظر گرفتن اولویت‌های کلینیکی (مانند اثرگذاری بیشتر،قیمت مناسب، ایمنی بالینی)، محدودیت‌های تجهیزات (سانتریفیوژ معمولی یا دستگاه تخصصی) و **بودجه موجود»، خواننده می‌تواند گزینه‌ی ایده‌آل خود را بر اساس جدول و تحلیل فوق انتخاب کند.